Чтобы начать подготовку образца, отделите истинный лист от фармакологически обработанного трансгенного образца Arabidopsis thaliana с помощью острого лезвия бритвы. Поместите настоящий лист на предметное стекло в каплю воды абаксиальной стороной вверх. Не спеша накройте настоящий лист покровным листом без пузырьков воздуха.
Для визуализации настройте траекторию луча, выбрав 514-нанометровый лазер для возбуждения желтого флуоресцентного белка или YFP. Получите высокое качество изображения за счет использования высокой мощности лазера. Включите PMT или HYD и определите пороговые значения верхней и нижней полос излучения на основе спектра для флуорофора YFP.
Установите окно обнаружения от 530 до 570 нанометров для сбора сигнала YFP. Для последовательного изображения второго цвета нажмите на кнопку поиска и добавьте новый канал. Во втором поиске выберите 555-нанометровый лазер для красного флуоресцентного белка, или возбуждения RFP, и установите окно обнаружения от 570 до 630 нанометров для сбора сигнала RFP.
Выберите 63-кратную линзу с сердечником мощностью 1,2 Вт в системе для визуализации активности движения субклеточной мембраны в устьичных клетках-предшественниках. Начните формат с размером изображения 1024 на 1024 пикселя, а затем оптимизируйте его в зависимости от коэффициента масштабирования и настроек объектива для получения хорошего разрешения. Затем настройте скорость сканирующей головки, начиная со скорости 400 герц, и оптимизируйте ее в зависимости от конкретной ситуации образцов.
Чтобы увеличить интересующую область без изменения объектива, введите коэффициент масштабирования, равный единице, и оптимизируйте его в соответствии с конкретными потребностями эксперимента. Линейное среднее относится к количеству раз, когда каждая линия X будет отсканирована для получения среднего результата. Начните с 2-кратного линейного среднего значения для визуализации событий мембранного трафика и оптимизируйте их по мере необходимости.
выберите режим сканирования XYT в режиме сбора, чтобы включить утилиту временных рядов. Затем выберите период ожидания между временными точками в разделе Временной интервал. Определите количество кадров, которые будут собраны, выбрав кадры.
Используйте режим сканирования Z-стека с проекцией максимальной интенсивности для сбора трехмерной информации о событии мембранного транспорта во всей клетке. Затем выберите режим сканирования XYZ в режиме сбора данных, после чего утилита Z-stack станет доступной. Выберите параметр Z-широкоугольный.
В режиме сканирования определите верхнее и нижнее изображения стека Z с помощью кнопок начала и конца. Затем определите толщину шага Z, щелкнув по размеру шага Z. Чтобы обработать изображение, перейдите на вкладку «Основной процесс» в программном обеспечении Confocal.
На вкладке «Открытые проекты» в крайнем левом углу выберите интересующий вас файл Z-стека. Затем на средней вкладке под названием Process tools выберите функцию проекции. Выберите максимум в выпадающем списке метода и нажмите на кнопку «Применить».
Проекционное изображение Z-стека будет сгенерировано на вкладке открытых проектов. Чтобы создать видео из изображений временных рядов, перейдите на вкладку «Файл» в программном обеспечении Fiji и откройте функцию, чтобы открыть все изображения временных рядов одно за другим в правильном порядке. Кроме того, можно перетащить изображения на изображение J, чтобы открыть данные в правильном порядке.
Затем найдите функцию стека на вкладке изображений и выберите изображения для наложения для создания видео. После этого сохраните файл в формате avi с желаемой частотой кадров. В истинном листе семидневных трансгенных растений, несущих промотор ERL1 ERL1 YFP, рассеянные клетки были выделены сигналом YFP, где ERL1 YFP метил плазматическую мембрану.
Также наблюдались множественные точечные сигналы, что позволяет предположить, что ERL1 также локализован в эндосомах. RFP Ara7 выделил множественные точечные сигналы почти во всех клетках, указывая на мультивезикулярные тельца, или MVB, в этих клетках. Когда RFP Ara7 сливался с сигналом ERL1 YFP, большинство пунктатов перекрывались, предполагая, что некоторые молекулы ERL1 YFP транспортировались к MVB.
Временные ряды истинных листьев, несущих ERL1 YFP и маркерный белок MVB RFP Ara7, показали, что меченные YFP эндосомы перемещались вместе с RFP Ara7 в клетках устьичной линии. Он подтвердил, что ERL1 YFP локализован в мультивезикулярных тельцах.
