Помеченные GFP фоторецепторные белки, такие как ионный канал TRPL GFP, позволяют нам изучать транспорт белка в нейронах с использованием неинвазивных методов. Этот метод также может быть использован для мониторинга дегенерации фоторецепторов. Таким образом, молекулярная основа наследственных заболеваний, приводящих к слепоте у человека, может быть изучена в глазу дрозофилы.
Клеточную локализацию белков, помеченных GFP, можно оценить, наблюдая флуоресценцию в глубоком псевдопупиле или с помощью водно-иммерсионной микроскопии. Оба метода позволяют быстро определять локализацию зрительных белков и наблюдать структурные дефекты рабдомеров вследствие дегенерации фоторецепторных клеток. Для получения высококачественных изображений наиболее важным аспектом является ориентация глаза мухи.
Выполняя эту технику, следует сосредоточиться на омматидиях, расположенных немного по направлению к периферии глаза. Я буду демонстрировать процедуру визуализации DPP, в то время как два метода с использованием водно-иммерсионной микроскопии будут продемонстрированы моей коллегой, доктором Кристиной Вагнер, и Маттиасом Зегером, аспирантом в нашей группе. Чтобы начать глубокое псевдопупил, или DPP, визуализацию, обезболивайте одно-трехдневных мух и расположите одну из них в центре объектива микроскопа на боку так, чтобы левый или правый глаз был обращен к цели точно радиально.
Увеличьте увеличение, чтобы оно соответствовало всему глазу, и центрируйте центральную омматидию глаза. Если возможно, уменьшите глубину резкости микроскопа, отрегулировав диафрагму с двойной радужкой до неглубокой установки. Далее включите УФ-лампу микроскопа с максимальной интенсивностью.
Затем выберите набор флуоресцентных фильтров микроскопа в соответствии с белком флуоресценции, экспрессируемым в глазах, и установите световой путь к камере, установленной на микроскопе. Используя функцию live imaging в программном обеспечении, отрегулируйте яркость изображения до настройки, которая обнаруживает только определенные сигналы от глаза, увеличивая время экспозиции и увеличивая значение. Перенастройте фокус микроскопа в глаз, чтобы создать наложенное изображение DPP.
Затем сделайте снимок флуоресцентного DPP. Чтобы приготовить муху в смертельной вариации, приклейте кусок пластилина на предметную горку и еще один кусок в центр чашки Петри. Наполните чашку Петри охлажденной льдом дистиллированной водой и ледяными хлопьями.
Затем поместите одну обезболенную льдом муху под стереомикроскоп поверх предметного слайда, покрытого пластилином. Поверните муху на спину, и проткните булавку насекомого через центр грудной клетки. Закрепите булавку горизонтально на предметном слайде, покрытом пластилином, и наведите левый или правый глаз мухи вверх.
Затем аккуратно зафиксируйте предмет скольжение его пластилиновой стороной вниз в чашке Петри, предотвращая вращение головки мухи. Убедитесь, что глаз мухи покрыт водой. В качестве альтернативы, чтобы подготовить муху в нелетальном варианте, переместите обезболенную льдом голову мухи сначала в 200-микролитрный наконечник пипетки и осторожно толкайте муху к кончику сжатым воздухом.
Затем, используя скальпель, отрежьте кончик пипетки прямо перед головой, а с помощью пинцета осторожно протолкните муху на несколько миллиметров в кончик пипетки. Снова отрежьте наконечник пипетки и сожмите сжатым воздухом муху обратно к кончику так, чтобы из кончика пипетки выступала только головка мухи. Приклеив кусок пластилина к предметному слайду, прижмите к нему кончик пипетки так, чтобы левый или правый глаз был направлен вверх.
Убедитесь, что глаз правильно ориентирован под микроскопом. Для получения изображения выберите цель погружения в воду. В случае нелетального варианта используйте лабораторную пипетку, чтобы приклеить большую каплю охлажденной воды к нижней стороне объекта погружения в воду.
Осторожно поместите предметный слайд с подготовленной мухой на ступень микроскопа. Затем опустите цель погружения в воду вручную, пока она не соприкоснется с поверхностью воды или глаз мухи не коснется капли. Затем переключите световой путь к камере микроскопа и создайте живое изображение.
Перенастройте фокус для камеры и оцените ориентацию глаза, учитывая, что глаз должен смотреть на объектив микроскопа радиально. Используйте программное обеспечение таблицы подстановки для обнаружения перенасыщения. В случае непигментированных мух отрегулируйте время экспозиции таким образом, чтобы самые яркие пиксели были чуть ниже предела насыщенности для каждого изображения.
Запишите изображение и сохраните его в виде необработанного файла для архивации всех соответствующих метаданных записи. Затем экспортируйте изображение в формате tif. Чтобы количественно оценить относительную флуоресценцию eGFP в рабдомерах микрофотоснимков погружения в воду, отрегулируйте параметры ImageJ, щелкнув «Анализировать», затем «Установить измерения» и установите флажок «Среднее значение серого».
Импортируйте изображение tif, щелкнув Файл, затем Открыть. Выберите репрезентативную область изображения в фокусе и увеличьте ее до 200–300%, многократно нажав клавишу «Control» и вместе. Затем выберите инструмент «Овал» и при нажатии клавиши «Shift» создайте на изображении круговую выделенную область, которая значительно меньше одного флуоресцентного рабдомера.
Затем найдите точный размер, отображаемый под панелью инструментов в главном окне ImageJ. Чтобы измерить интенсивность флуоресценции в круговом выделении, переместите круг к первому рабдомеру с помощью клавиш со стрелками на клавиатуре и нажмите «Анализировать», затем «Измерить». Появится окно результатов со списком измеренного серого значения.
Продолжайте измерения рабдомеров от двух до шести, а также измеряйте фоновый сигнал. В случае непигментированных мух сделайте дополнительные измерения соответствующих участков тела клеток. Измерьте флуоресценцию еще двух омматидий, в результате чего получится три технические реплики.
Отметьте анализируемую омматидию с помощью инструмента «Карандаш» и сохраните это изображение для документации. Выберите и скопируйте измеренные серые значения из окна результатов и вставьте их в программное обеспечение для работы с электронными таблицами для дальнейших вычислений. Отсортируйте значения интенсивности флуоресценции в соответствии с их происхождением по категориям рабдомер, тело клетки и фон и рассчитайте среднюю интенсивность из каждой категории.
Затем рассчитайте относительное количество eGFP, присутствующего в рабдомере, используя первую формулу для непигментированных глаз и вторую для пигментированных глаз. В качестве альтернативы, чтобы количественно оценить морфологию глаза с помощью флуоресценции eGFP на микроснимках погружения в воду, выберите три смежные омматидии в репрезентативной области изображения, которая находится в фокусе. Оцените 18 рабдомеров выделения по отдельности в соответствии с их интенсивностью eGFP, резкостью краев и контрастностью по отношению к окружающему фоновому сигналу.
Наконец, оцените четко видимые рабдомеры со значением два, еженедельные видимые рабдомеры со значением единицы и отсутствующие рабдомеры со значением ноль, чтобы сгенерировать индекс вырождения. У трансгенных мух Drosophila, экспрессирующих синтез белка eGFP TRPL, рабдомеральная флуоресценция исчезает при свете из-за транслокации eGFP TRPL. Это позволяет выполнить генетический скрининг для выявления мутантов, дефективных в интернализации eGFP TRPL.
У контрольных мух eGFP TRPL перемещается из рабдомеров в тело клетки после 16 часов освещения, что приводит к значительному снижению рабдомеральной флуоресценции по сравнению с темным адаптированным состоянием. Вторая темная инкубация снова повышает рабдомеральную флуоресценцию к исходному значению. Однако в транслокационном дефектном мутанте TRPL vps35MH20 картина флуоресценции не изменяется резко после 16 часов освещения и последующей темной адаптации в течение 24 часов.
Этот метод количественной оценки может обнаружить статистически высокозначимый дефект рециркуляции. Белоглазые мухи позволяют обнаруживать флуоресцентные сигналы как от рабдомера, так и от тела клетки. Напротив, у красноглазых мух флуоресцентные сигналы обнаруживаются только в рабдомерах, но не в теле клетки.
Что касается количественной оценки дегенерации сетчатки, флуоресценция eGFP TRP может быть оценена в течение нескольких недель. При содержании в 12-часовом световом, 12-часовом темном цикле в течение двух недель индекс дегенерации снижался у мутантных мух, но не у контрольных мух. В этом протоколе нужно различать пигментированные и непигментированные глаза.
Поскольку пигментация влияет на флуоресцентный сигнал, количественная водно-иммерсионная микроскопия была оптимизирована для обоих случаев индивидуально. Визуализация DPP и водоиммерсионная микроскопия являются высокопроизводительными методами с ограниченным разрешением. Для исследования субклеточной локализации мы рекомендуем иммунофлуоресцентную микроскопию на участках тканей.
Для детального анализа дегенеративных фенотипов может быть выполнена электронная микроскопия.
