Для начала возьмите мозг, изолированный от усыпленных детенышей мышей, и поместите его в трехсантиметровую чашку Петри, содержащую холодный MEM с EBSS и 2X PSN. Под препарирующим эндоскопом отделите полушария мозга, удалите и отбросьте средний мозг, гиппокамп и мозговые оболочки. Поместите оба корковых полушария в 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую пять миллилитров MEM EBSS с 2X PSN, и держите на льду.
В вытяжке для культуры тканей отсасывайте среду из 50-миллилитровой конической трубки с помощью пипетки, оставляя кусочки кортикальной ткани на дне. Добавьте 10 миллилитров предварительно подогретой диссоциационной среды с помощью стеклянной пипетки с покрытием и растирайте ткань от 10 до 20 раз. Переложите суспензию в 50-миллилитровую мензурку, содержащую небольшую полоску для перемешивания, и поместите ее на тарелку для перемешивания.
Затем снимите стакан, установите его под углом 30 градусов на три минуты, чтобы дать ткани осесть, и перенесите клеточную суспензию в новую 50-миллилитровую коническую трубку на льду. Центрифугируйте 50-миллилитровую коническую пробирку при 1000G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Замените надосадочную жидкость глиальной питательной средой и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
Поместите клетки с плотностью один миллион в 10-сантиметровые чашки, обработанные клеточными культурами, и инкубируйте в течение 24 часов. Затем замените среду свежей глиальной средой и дайте клеткам достичь 100% слияния в течение двух недель, прежде чем выставлять их на эксперименты. Поместите 100 000 глиальных клеток в лунку в шестилуночных планшетах и позвольте им достичь от 80% до 100% слияния для прионной инфекции in vitro.
Подвергайте воздействию ультрафиолетового света на 20% разбавленные гомогенаты мозга и PBS в течение 30 минут. Аспирируйте среду из инфицированной глии и добавьте от 1,5 до 2 миллилитров глиальной питательной среды с 0,1% нормального или прионного гомогената мозга на лунку. Через 72 часа удалите среду, промойте клетки PBS и добавьте свежую глиальную среду для роста.
Осторожно аспирируйте жировую ткань примерно в одном миллилитре HBSS в 0,25% растворе трипсина, используя серологическую пипетку. Перенесите ткань в четырехсантиметровую чашку Петри, содержащую два миллилитра среды DMEM F-12 с Dnase-1, коллагеназой и смесью Dispase. Затем разрежьте жировую ткань на небольшие кусочки с помощью ножниц и выдержите смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение 1,5 часов.
Перенесите ткань в 50-миллилитровую коническую трубку, растирайте ткань и скапливайте стромальную сосудистую фракцию, которая будет казаться красной. После промывки гранулы стерильным PBS и центрифугирования в течение трех минут повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре среды ADMSC. После этого пипетируйте клеточную суспензию через 40-микрометровое ситечко в стерильную коническую пробирку объемом 50 миллилитров, чтобы удалить недиссоциированную ткань.
Добавьте девять миллилитров среды ADMSC в 10-сантиметровую чашку, обработанную клеточными культурами. Пипеткой введите в нее процеженную клеточную суспензию и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Смените среду на следующий день и пропустите клетки, как только они достигнут 80-90% конфлюенции.
После того, как клетки претерпят два-три прохода, ресуспендируйте их в трех-10 миллилитрах среды и посчитайте с помощью гемоцитометра. Планшет 100 000 клеток в лунку в шестилуночных планшетах, содержащих среду ADMSC, и инкубировать в течение ночи, как показано ранее. На следующий день приготовьте среду ADMSC для цитокин-стимулированных клеток с концентрацией 10 нанограммов на миллилитр ФНО-альфа или 200 нанограммов на миллилитр ИФН-гамма.
Для контрольных образцов создают среды ADMSC с конечной концентрацией 0,1% прион-инфицированного или нормального гомогената мозга. Отсадите старую среду, добавьте в соответствующие лунки в трех экземплярах по 1,5 миллилитра цитокина или гомогенатсодержащей среды мозга, а затем верните тарелки в инкубатор. Затем промойте клетки PBS и изолируйте РНК, добавив в каждую лунку 350 микролитров буфера для лизиса с 1% бета-меркаптоэтанола.
Удалите клеточные лизаты с помощью клеточного лифтера и выполните обратную транскрибацию 25 нанограммов РНК на образец и амплификацию комплементарной ДНК. Микроглия на планшете BV2 в дозе 50 000 клеток на лунку или первичная смешанная глия на уровне 100 000 клеток на лунку в шестилуночном планшете. Обрабатывайте клетки BV2 средой, содержащей 0,1% инфицированного прионами или нормального гомогената мозга, и инкубируйте в течение 72 часов.
После инкубации промойте клетки два раза PBS, чтобы удалить оставшийся гомогенат мозга. Добавьте в клетки свежие среды и верните тарелку в инкубатор. Чтобы стимулировать ADMC, обрабатывайте их 10 нанограммами на миллилитр TNF-альфа в течение 24 часов перед совместным культивированием с BV2 или смешанной глией.
Трижды промойте стимулированные ADMC с PBS и вращайте суспензию ADMSC, как было показано ранее. Замените среды на ячейках BV2 или смешанной глии двумя миллилитрами на лунку среды ADMSC, а в половину лунок поместите вкладыши для шестилуночных планшетов с размером пор 0,4 мкм. Добавьте два миллилитра фильтрующего материала ADMSC в каждую вставку и добавьте еще два миллилитра фильтрующего материала в лунки, которые не принимают вставки.
После гранулирования, ресуспендирования и подсчета ADMC добавьте от 50 000 до 100 000 клеток в каждую вставку и инкубируйте их. В конце инкубации извлеките и выбросьте вкладыши или замените их на новую шестилуночную пластину и дважды промойте вкладыши PBS. Добавьте буфер, предоставленный набором для выделения РНК, в смешанные клетки глии или BV2 и соскребите лунки.
