저자는 Lab Animal Resources의 축산업에 감사를 표합니다. 이 원고의 자금 출처에는 Boettcher Fund, Murphy Turner Fund, CSU College of Veterinary Medicine 및 Biomedical Sciences College Research Council이 포함됩니다. 그림 2A, 그림 2C 및 그림 3A 는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.

마우스는 콜로라도 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)가 승인한 프로토콜 #1138에 따라 국제 실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회(Association for Assessment and Accreditation of Lab Animal Care International)의 인증을 받은 콜로라도 주립 대학의 실험실 동물 자원(Lab Animal Resources)에서 사육 및 유지되었습니다.
1. 프리온으로 원발성 피질 혼합 아교세포를 분리하고 감염시키는 것
<ol><li>성상교세포(astrocyte)와 미세아교세포(microglia)를 모두 포함하는 원발성 혼합교세포(primary mixed glia)를 분리하기 위해, 0일에서 2일 된 생쥐 새끼 C57Bl/6을 획득합니다. 참고: 이 프로토콜은 이전 프로토콜 15,16에서 조정되었습니다.</li>
	<li>참수로 한 번에 한 마리씩 새끼를 안락사시키고 뇌를 추출하여 소뇌와 뇌간을 분리하고 폐기합니다.<ol><li>2x 페니실린/스트렙토마이신/네오마이신(PSN)이 포함된 차가운 MEM/EBSS가 들어 있는 3cm 페트리 접시에 뇌를 놓습니다. 해부 범위에서 뇌 반구를 분리하고 중뇌를 제거하고 버립니다. 피질에서 해마와 수막을 제거하고 버립니다.</li>
		<li>5mL의 MEM/EBSS + 2x PSN이 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브에 두 피질 반구를 놓고 얼음 위에 놓습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>조직 배양 후드에서 피펫으로 부드럽게 흡인하여 50mL 원뿔형 튜브에서 배지를 제거하고 피질 조직 조각은 튜브 바닥에 남겨 둡니다. 코팅된 유리 피펫을 사용하여 10mL의 예열된 해리 배지를 추가하고 유리 피펫으로 조직을 10-20배 삼각화합니다.</li>
	<li>현탁액을 작은 교반 막대가 들어 있는 50mL 비커로 옮기고 가장 낮은 설정인 약 30rpm에서 10분 동안 교반 플레이트에 놓습니다. 교반 플레이트에서 비커를 제거하고 30분 동안 3° 각도로 설정하여 조직이 바닥에 가라앉을 수 있도록 합니다. 세포 현탁액(상층액)을 제거하고 얼음 위에 있는 새 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>DNase-I(4,000U/mL)를 10mL의 해리 배지에 넣고 조직을 재현탁시키고 추가로 10분 동안 저어줍니다. 새로운 해리 매체(DNase-I 제외)를 2-4회 추가하고(사용된 새끼 쥐 2마리당 1회) 세포 현탁액을 얼음 위의 50mL 원뿔형 튜브로 옮기는 방식으로 반복합니다.</li>
	<li>4°C에서 1,000× g 의 원추형 튜브에서 셀 현탁액을 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 신경교 성장 배지로 교체합니다. 혈구계로 세포를 계수하고 106 in 10 cm 세포 배양 처리 접시의 밀도로 세포를 플레이트합니다. 37 ° C의 인큐베이터에 5 % CO2 와 함께 넣습니다.</li>
	<li>24시간 후 미디어를 제거하고 새로운 신경교 미디어로 교체합니다. 세포가 2주 이내에 100% 합류점에 도달하도록 하십시오. 그런 다음 실험을 위해 분리하고 접시에 담습니다.</li>
	<li>시험관 내 프리온 감염의 경우 6-웰 플레이트에서 웰당 100,000개의 세포로 신경교세포를 플레이트하고 80%-100% 합류에 도달할 수 있도록 합니다. PBS에서 20%로 희석된 프리온 및 정상 뇌 균질액을 세포 배양에 추가하기 전에 30분 동안 UV 광선에 노출시킵니다. 감염될 신경교세포에서 액액을 흡인하고 각 웰에 0.1% 정상 또는 프리온 뇌 균질액의 최종 부피를 포함하는 1.5-2mL의 신경교세포 성장 배지를 추가합니다.</li>
	<li>72시간 후 배지를 흡인하고 PBS로 세포를 세척하여 잔류 뇌 균질액을 제거합니다. 신선한 신경교세포 성장 배지(뇌 균질액 없음)로 교체하십시오.</li>
	<li>AdMSCs 세포를 분리하려면 혈청학적 피펫을 사용하여 ~1mL의 HBSS/Trypsin 용액과 함께 지방 조직을 부드럽게 흡인합니다. 200 U/mL DNase-I 및 400 U/mL 콜라겐분해효소/Dispase 혼합물과 함께 2 mL의 DMEM/F12 배지가 들어 있는 4cm 페트리 접시에 옮깁니다. 작은 가위로 지방 조직 덩어리를 작은 조각(크기 5mm 미만)으로 자르고 37°C에서 1.5시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>페트리 접시의 내용물을 혈청학적 피펫이 있는 50mL 원뿔형 튜브로 옮기고 혼합물을 피펫으로 ~10배 triturate합니다. 조직이 쉽게 분리되고 상대적으로 균질한 혼합물을 형성하는지 확인하십시오. 혼합물을 4°C에서 1,000× g 에서 5분 동안 원심분리하여 빨간색으로 나타나는 기질 혈관 분획을 펠릿화합니다.</li>
	<li>상층액을 조심스럽게 흡입하고 5mL의 예열된 멸균 PBS로 펠릿을 세척하고 4°C에서 1,000× g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 펠릿을 1mL의 AdMSC 배지(L-글루타민을 함유하고 15% 열불활성화 소 태아 혈청(hiFBS), 1% 아미노산, 1% 비필수 아미노산 및 1% PSN이 보충된 저포도당 DMEM)에 재현탁시킵니다.</li>
	<li>새로운 멸균 50mL 코니컬 튜브 위에 40μm 세포 여과기를 놓고 여과기를 통해 세포 현탁액을 피펫하여 해리되지 않은 조직을 제거합니다. 10cm 세포 배양 처리된 접시에 9mL의 AdMSC 배지를 추가하고 변형된 세포 현탁액을 접시에 피펫합니다. 37 ° C의 인큐베이터에 5 % CO2 와 함께 넣습니다.</li>
	<li>다음 날 제거하고 새 AdMSC 미디어로 교체합니다. 세포가 80-90% 합류할 때까지 기다렸다가 72시간에서 96시간 사이를 통과할 준비가 될 때까지 기다립니다.</li>
	<li>위에서 설명한 대로 AdMSC를 분리하고 두 번 통과시켜 일관된 균질한 집단을 얻습니다 14. 멸균 PBS로 세포를 두 번 세척하고 각 플레이트에 미리 데워진 트립신 2mL(0.25%)를 피펫합니다. 37°C에서 5분 동안 또는 플레이트에서 완전히 떨어질 때까지 세포를 배양합니다. 각 플레이트에 8mL의 사전 예열된 AdMSC 배지를 추가하고, 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 혼합하고, 원추형 튜브로 옮기고, 4°C에서 1,000 ×g 으로 원심분리하여 펠릿으로 만듭니다.</li>
	<li>3-10mL의 배지에 AdMSC를 재현탁시키고(사용된 플레이트 수에 따라 다름) 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다. AdMSC 매체가 포함된 6웰 플레이트에서 100,000개 세포/웰을 플레이트합니다. 37 ° C의 인큐베이터에 5 % CO2 와 함께 밤새 넣습니다.</li>
	<li>다음 날, 사이토카인(cytokine) 또는 뇌 균질화(brain homogenate)로 세포를 자극합니다.<ol><li>사이토카인 자극 세포의 경우 10ng/mL TNFα 또는 200ng/mL IFNγ를 포함하는 AdMSC 배지를 만듭니다. 제어 웰을 위해 새 매체를 사용하십시오.</li>
		<li>프리온에 감염된 뇌 균질화 치료의 경우, 말기에 감염된 프리온 마우스(22L 또는 RML 균주)에서 20%의 뇌 균질액(PBS)을 얻습니다. 대조군을 위해 0.1% 프리온 감염 또는 정상 뇌 균질화의 최종 농도로 AdMSC 배지를 만듭니다.</li>
		<li>웰에서 배지를 흡입하고 1.5mL의 사이토카인 또는 뇌 균질액 함유 배지를 해당 웰에 피펫합니다. 세 번에 걸쳐 수행합니다. 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다.</li>
	</ol></li>
	<li>배지를 제거하고, 예열된 PBS로 세포를 2배 세척하고, 1% βME를 포함하는 용해 완충액 350mL를 각 웰에 첨가하여 RNA를 분리하고, 세포 리프터를 사용하여 세포 용해물을 제거합니다. DNase 분해 단계를 포함하여 mini kit 제조업체의 프로토콜에 따라 RNA 분리를 수행합니다. RT-qPCR의 경우 샘플당 25ng의 RNA를 역전사하고 10mM에서 각 유전자에 대해 SYBR Green 및 primer로 cDNA를 증폭합니다. 2-ΔΔCT 방법을 사용하여 mRNA 발현을 분석하고 참조 유전자 β-actin 17의 발현으로 정규화합니다. 참고: 모든 RT-PCR은 MIQE 지침에 따라 수행되었습니다.</li>
	<li>웰당 50,000개의 세포로 BV2 미세아교세포를 플레이트링하거나 6웰 플레이트에서 웰당 100,000개의 세포로 1차 혼합 신경교세포를 플레이트합니다. 다음 날 BV2 세포를 0.1% 프리온 감염 또는 정상 뇌 균질액이 포함된 배지로 처리합니다. 혼합성 신경교세포의 경우 세포가 80-90% 합쳐져 뇌 균질액으로 감염될 때까지 기다립니다.</li>
	<li>뇌를 함유한 배지에서 세포를 배양하고 72시간 동안 균질화합니다. PBS로 세포를 2배 세척하여 남아 있는 뇌 균질화를 제거하고 새로운 배지를 추가한 후 인큐베이터로 돌아갑니다.</li>
	<li>공동 문화를 위해 통로 3의 AdMSC를 사용합니다. AdMSC를 자극하는 경우 10ng/mL TNFα가 포함된 배지를 사용하고 BV2 또는 혼합 신경교세포와 병용 배양하기 전에 24시간 동안 치료합니다. 자극된 AdMSC를 PBS로 3배 세척하여 남아 있는 TNFα를 제거했습니다.</li>
	<li>1.15단계에 설명된 대로 AdMSC를 트립시화하고 AdMSC 배지에 재현탁합니다.</li>
	<li>AdMSC 현탁액을 4°C에서 1,000× g 에서 5분 동안 회전시킵니다. 이 시간 동안 BV2 세포 또는 혼합 신경교세포의 배지를 AdMSC 배지 웰당 2mL로 교체하고 공극 크기가 0.4마이크로미터인 6웰 플레이트용 인서트를 웰의 절반에 넣습니다. 각 인서트에 2mL의 AdMSC 배지를 추가하고 인서트를 받지 않는 웰에 2mL의 배지를 추가로 추가합니다.</li>
	<li>AdMSC의 펠릿화가 완료되면 AdMSC 매체에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 혈구계로 AdMSC를 계수하고 각 삽입물에 50,000-100,000개의 세포를 추가합니다.</li>
	<li>BV2 세포의 경우 24시간 동안 공동 배양합니다. 혼합성 신경교세포의 경우, 짧게는 24시간, 길게는 7일 동안 배양합니다.</li>
	<li>원하는 시간 동안 AdMSC로 배양한 후 인서트를 제거하고 폐기하거나 새 6웰 플레이트에 넣고 PBS로 인서트를 2회 세척하고 RNA 분리 키트에서 제공하는 완충액을 혼합 신경교세포 또는 BV2 세포에 추가하고 인서트를 긁어 AdMSC RNA를 분석합니다.</li>
	<li>통로 2의 AdMSC를 10ng/mL TNFα가 포함된 배지로 처리합니다. 다음 날, 예열된 멸균 PBS 3x로 세포를 세척하고 혈청이 없는 AdMSC 배지에서 4시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>이동 세포 분석을 수행하려면 인서트당 25,000개의 AdMSC를 추가하고 37°C에서 24시간 동안 세포를 배양합니다. 이 시간 동안 이동 세포는 삽입체의 상단 챔버에서 이동하여 삽입체의 아래쪽에 부착됩니다. 웰과 인서트의 내용물을 조심스럽게 흡입하고 PBS로 2회 세척하고 각 웰에 1mL의 PBS를 남겨 인서트의 양쪽이 축축한 상태로 유지되도록 합니다.</li>
	<li>집게를 사용하여 한 번에 하나씩 삽입물을 제거하고 면봉으로 상단 챔버를 부드럽지만 철저하게 닦아 이동하지 않은 세포를 제거합니다. 나머지 PBS를 흡입하고 500μL의 결정 보라색 용액을 인서트의 웰과 상단 챔버 모두에 피펫하여 인서트 멤브레인이 완전히 잠기도록 합니다.</li>
	<li>인서트를 실온의 크리스탈 바이올렛 용액에서 1시간 동안 배양합니다. 컬러를 가장 잘 유지하려면 한 번에 하나의 인서트만 사용하여 다음 단계를 빠르게 수행하십시오.<ol><li>인서트의 웰과 상단 챔버에서 크리스탈 바이올렛 용액을 흡입하고 PBS로 3번 세척합니다. 면봉으로 상단 챔버를 다시 닦습니다.</li>
		<li>인서트를 1mL의 PBS가 들어 있는 새 24웰 플레이트의 웰에 넣습니다. 카메라가 부착된 도립 현미경 위에 플레이트를 놓습니다. 10x 대물렌즈를 사용하여 인서트의 아래쪽에만 초점을 맞춰 인서트 중앙을 향해 4개의 무작위 영역의 이미지를 촬영합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>각 웰에 대해 이 작업을 수행한 후 선택한 이미지 처리 소프트웨어에 이미지를 업로드하고 배경을 조정하여 보라색으로 염색된 셀과의 대비를 향상시킵니다. 셀 카운터를 사용하여 수동으로 셀을 계산합니다.</li>
</ol>

프리온 유발 염증을 줄이기 위한 AdMSCs 및 신경교세포 공동 배양

<ol>
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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-gamma+and+TNF-alpha+differentially+regulate+immunomodulation+by+murine+mesenchymal+stem+cells.">IFN-gamma and TNF-alpha differentially regulate immunomodulation by murine mesenchymal stem cells.</a> Immunology Letters. 110 (2), 91-100 (2007).</li><li>Hemeda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+differentially+affect+cytokine+expression+and+migration+properties+of+mesenchymal+stem+cells.">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha differentially affect cytokine expression and migration properties of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 19 (5), 693-706 (2010).</li><li>Carta, M., Aguzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+foundations+of+prion+strain+diversity.">Molecular foundations of prion strain diversity.</a> Current Opinion in Neurobiology. 72, 22-31 (2022).</li><li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+microglia+and+macrophages+in+brain+injury+and+repair.">Phagocytic microglia and macrophages in brain injury and repair.</a> CNS Neuroscience and Therapeutics. 28 (9), 1279-1293 (2022).</li><li>Sinha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+activities+of+reactive+microglia+and+astrocytes+associated+with+prion+diseases+are+dysregulated+in+opposite+directions.">Phagocytic activities of reactive microglia and astrocytes associated with prion diseases are dysregulated in opposite directions.</a> Cells. 10 (7), 1728 (2021).</li><li>Stansley, B., Post, J., Hensley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+review+of+cell+culture+systems+for+the+study+of+microglial+biology+in+Alzheimer's+disease.">A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 115 (2012).</li><li>Shan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+effect+of+autologous+compact+bone-derived+mesenchymal+stem+cell+transplantation+on+prion+disease.">Therapeutic effect of autologous compact bone-derived mesenchymal stem cell transplantation on prion disease.</a> Journal of General Virology. 98 (10), 2615-2627 (2017).</li><li>Johnson, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+immune+cells+trafficking+fluorescent+prion+rods+hours+after+intraperitoneal+infection.">Monitoring immune cells trafficking fluorescent prion rods hours after intraperitoneal infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2349 (2010).</li><li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-secreted+TGF-beta+regulates+lipopolysaccharide-stimulated+macrophage+M2-like+polarization+via+the+Akt/FoxO1+pathway.">MSC-secreted TGF-beta regulates lipopolysaccharide-stimulated macrophage M2-like polarization via the Akt/FoxO1 pathway.</a> Stem Cell Research and Therapy. 10, 345 (2019).</li></ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

여기에서는 신경교세포 모델에서 프리온 유발 염증을 감소시키는 지방 유래 중간엽 기질 세포(AdMSCs)의 효과를 평가하기 위한 신뢰할 수 있고 상대적으로 저렴한 프로토콜을 보여줍니다. AdMSC는 배양에서 쉽게 분리하고 증식하여 1주일 이내에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 면역형광 및 유세포 분석에 의해 중간엽 기질 세포의 마커와 일치하는 마커를 발현하는 이종 세포 집단을 일관되게 생?...

신경교세포 염증은 파킨슨병, 알츠하이머병, 프리온 질환 등 다양한 신경퇴행성 질환에서 중요한 역할을 합니다. 비정상적인 단백질 응집은 질병 발병 기전과 신경 퇴행의 많은 원인에 기인하지만, 신경교세포(glial cell)도 이 1,2,3을 악화시키는 역할을 합니다. 따라서 신경교세포 유발 염증을 표적으로 하는 것은 유망한 치료법입니다. 프리온 질환에서 세포 프리온 단백질(PrPC)은 질병 관련 프리온 단백질(PrPSc)로 잘못 접혀 올리고머를 형성하고 응집하여 뇌의 항상성을 방해합니다 4,5,6.
프리온 질환의 초기 징후 중 하나는 성상교세포(astrocyte)와 미세아교세포(microglia)의 염증 반응입니다. 미세아교세포(microglia)를 제거하거나 성상세포(astrocyte)를 변형시켜 이러한 반응을 억제하는 연구는 일반적으로 동물 모델에서 질병 발병기전을 개선하지 않거나 악화시키는 것으로 나타났습니다 7,8,9. 신경교 염증을 제거하지 않고 조절하는 것은 치료법으로서 흥미로운 대안입니다.
중간엽 기질 세포(MSCs)는 파라크린 방식으로 염증을 조절하는 능력으로 인해 다양한 염증성 질환의 치료법으로 자리 잡았습니다 10,11. 그들은 항염증 분자, 성장 인자, microRNA 등을 분비함으로써 염증 부위로 이동하고 이러한 환경에서 신호 분자에 반응하는 능력을 보여주었습니다 10,12,13. 우리는 이전에 지방 조직에서 유래한 MSC(AdMSC로 표시)가 프리온에 감염된 뇌 균질액으로 이동하고 항염증성 사이토카인 및 성장 인자에 대한 유전자 발현을 상향 조절함으로써 이 뇌 균질액에 반응할 수 있음을 입증했습니다.
또한, AdMSC는 BV2 미세아교세포와 원발성 혼합교세포(primary mixed glia 14) 모두에서 3(NLRP3) 인플라마좀 신호전달 및 신경교세포 활성화를 포함하는 Nod-Like Receptor family pyrin domain인 Nuclear Factor-kappa B(NF-κB)와 관련된 유전자의 발현을 감소시킬 수 있습니다. 여기에서는 마우스에서 AdMSC와 원발성 혼합 신경교세포를 모두 분리하고, AdMSC를 자극하여 조절 유전자를 상향 조절하고, AdMSC 이동을 평가하고, AdMSC를 프리온 감염 신경교세포와 함께 배양하는 방법에 대한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 이러한 절차가 신경 퇴행성 및 기타 질병에서 신경교 유발 염증을 조절하는 데 있어 MSC의 역할에 대한 추가 연구를 위한 기초를 제공할 수 있기를 바랍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipets</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229005B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dishes</td>
			<td>Peak Serum</td>
			<td>PS-4002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml serological pipets</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>667015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>667050B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV2 microglia cell line</td>
			<td>AcceGen Biotech</td>
			<td>ABC-TC212S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifter</td>
			<td>Biologix Research Company</td>
			<td>70-2180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>&#160;12785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>DFL14-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-I</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential amino acids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11130051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (100%)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>EX0276-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td>Peak Serum</td>
			<td>PS-FB4</td>
			<td>Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1.04003.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass 10 mL serological pipet</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;7077-10N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balances Salt Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8264-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer/Neubauer Chamber</td>
			<td>Daigger</td>
			<td>HU-3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Glucose DMEM</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low glucose DMEM containing L-glutamine</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30021.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM/EBSS</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30024.FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-essential amino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7145-100M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>219998320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin/neomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4083-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>&#160;SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IFN-gamma Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>485-MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>410-MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmacote</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SL2-100ML</td>
			<td>Coat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemxyme</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004106</td>
			<td>Collagenase/Dispase mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile, individually wrapped cotton swab</td>
			<td>Puritan Medical</td>
			<td>&#160;25-8061WC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 &#181;m</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 &#181;m</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657641</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adipose-derived mesenchymal stromal cells co-cultured with primary mixed glia to reduce prion-induced inflammation

중간엽 기질 세포(MSC)는 항염증성 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자의 생성을 통해 염증을 강력하게 조절합니다. 이 세포는 프리온 질환 및 기타 단백질 접힘 장애와 같은 신경 퇴행성 질환의 맥락에서 신경 염증을 조절하는 능력을 보여줍니다. 프리온 질환은 산발적이거나, 후천적이거나, 유전적일 수 있습니다. 이는 뇌에서 프리온 단백질의 잘못된 접힘과 응집으로 인해 발생할 수 있습니다. 이러한 질병은 항상 치명적이며 사용할 수 있는 치료법이 없습니다.
질병의 초기 징후 중 하나는 성상교세포와 미세아교세포의 활성화 및 관련 염증으로, 이는 감지 가능한 프리온 응집과 신경 세포 손실 이전에 발생합니다. 따라서 MSC의 항염증 및 조절 특성을 수확하여 프리온 질환에서 성상교증을 치료할 수 있습니다. 최근에는 BV2 세포 또는 원발성 혼합 신경교세포와 함께 배양한 지방 유래 MSC(AdMSCs)가 파라크린 신호전달을 통해 프리온 유발 염증을 감소시킨다는 것을 보여주었습니다. 이 논문은 프리온 유발 염증을 줄이기 위해 자극된 AdMSC를 사용하는 신뢰할 수 있는 치료법에 대해 설명합니다.
AdMSC의 이형접합 집단은 쥐 지방 조직에서 쉽게 분리하고 배양에서 확장할 수 있습니다. 염증성 사이토카인으로 이러한 세포를 자극하면 프리온에 감염된 뇌 균질화로 이동하고 이에 대한 반응으로 항염증 조절제를 생성하는 능력이 향상됩니다. 이러한 기법은 프리온 감염에 대한 MSC의 치료 가능성을 조사하는 데 사용할 수 있으며 다른 단백질 접힘 및 신경 염증성 질환에도 적용할 수 있습니다.

Glial inflammation plays a key role in a variety of neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s, Alzheimer&#39;s, and prion disease. Although abnormal protein aggregation is attributed to much of disease pathogenesis and neurodegeneration, glial cells also play a part in exacerbating this 1,2,3. Therefore, targeting glial-induced inflammation is a promising therapeutic approach. In prion disease, the cellular prion protein (PrPC) misfolds to the disease-associated prion protein (PrPSc), which forms oligomers and aggregates and disrupts homeostasis in the brain 4,5,6.
One of the earliest signs of prion disease is an inflammatory response from astrocytes and microglia. Studies suppressing this response, either by removal of microglia or modification of astrocytes, have generally shown no improvement on, or worsened, disease pathogenesis in animal models 7,8,9. Modulating glial inflammation without eliminating it is an intriguing alternative as a therapeutic.
Mesenchymal stromal cells (MSCs) have taken the stage as a treatment for a variety of inflammatory diseases, due to their ability to modulate inflammation in a paracrine manner 10,11. They have shown the ability to migrate to sites of inflammation and respond to signaling molecules in these environments by secreting anti-inflammatory molecules, growth factors, microRNAs, and more 10,12,13. We have previously demonstrated that MSCs derived from adipose tissue (denoted AdMSCs) are able to migrate toward prion-infected brain homogenate and respond to this brain homogenate by upregulating gene expression for anti-inflammatory cytokines and growth factors.
Moreover, AdMSCs can decrease the expression of genes associated with Nuclear Factor-kappa B (NF-&#954;B), the Nod-Like Receptor family pyrin domain containing 3 (NLRP3) inflammasome signaling, and glial activation, in both BV2 microglia and primary mixed glia 14. Here, we provide protocols on how to isolate both AdMSCs and primary mixed glia from mice, stimulate AdMSCs to upregulate modulatory genes, assess AdMSC migration, and co-culture AdMSCs with prion-infected glia. We hope that these procedures can provide a foundation for further investigation of the role of MSCs in regulating glial-induced inflammation in neurodegenerative and other diseases.

저자 스포트라이트: 프리온 질환 연구의 발전에 대한 통찰력

프리온 유발 염증을 줄이기 위해 원발성 혼합 신경교세포와 공동 배양된 지방 유래 중간엽 기질 세포

Our work focuses on prion diseases, which are fatal neurodegenerative diseases caused by the misfolding of the prion protein in the brain. Few studies have focused on the impact of glial cells on neuronal death. We want to understand if halting inflammation caused by glial cells can be a therapeutic approach.There has been a recent discovery in the mesenchymal stromal cell field, revealing that the protective properties stem from the extracellular vesicles they release. We aim to delve deeper into the contents of these vesicles and understand how they provide protection against prion-induced glial inflammation. Currently in the field of neurodegeneration, there are a few avenues that are successful at halting neuroinflammation.These include small molecules and genetic modulation using adeno or lentiviruses. However, none have been able to fully reduce inflammation, specifically in large areas of the brain. The most significant finding that we have been able to establish is that through cell therapy, we are able to slow prion-disease progression through inhibition of glial inflammation.The use of a combined with the primary glial-cell model of disease will allow us to continue to ask about cellular stress pathways important in neuroprotection, in a more efficient and direct matter than the use of solely in-vivo models.

TNFα 또는 인터페론 감마(IFNγ)로 AdMSC를 24시간 동안 자극하면 항염증 분자 및 성장 인자의 발현 변화를 유도합니다. AdMSC를 TNFα 또는 인터페론 감마(IFNγ)로 처리하면 TNF 자극 유전자 6(TSG-6) mRNA가 증가하는 반면, TNFα는 IFNγ가 아닌 형질전환성장인자베타-1(TGFβ-1) mRNA가 증가합니다. TNFα 또는 IFNγ로 자극하면 혈관 내피 성장 인자(VEGF) mRNA의 증가를 유도하지만 섬유아세포 성장 인자(FGF) m...

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지방 유래 중간엽 기질 세포(AdMSC)는 염증과 관련된 질병을 치료하는 데 유용한 강력한 면역 조절 특성을 가지고 있습니다. 쥐 AdMSC와 원발성 혼합 신경교세포를 분리 및 배양하고, AdMSC를 자극하여 항염증 유전자 및 성장 인자를 상향 조절하고, AdMSC의 이동을 평가하고, 원발성 혼합 프리온 감염 신경교세포와 AdMSC를 공동 배양하는 방법을 보여줍니다.

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are potent regulators of inflammation through the production of anti-inflammatory cytokines, chemokines, and growth ...

우리의 연구는 뇌의 프리온 단백질이 잘못 접혀서 발생하는 치명적인 신경 퇴행성 질환인 프리온 질환에 초점을 맞추고 있습니다. 신경교세포가 신경세포 사멸에 미치는 영향에 초점을 맞춘 연구는 거의 없습니다. 우리는 신경교세포로 인한 염증을 멈추는 것이 치료적 접근법이 될 수 있는지 이해하고자 합니다.최근 중간엽 기질 세포 분야(mesenchymal stromal cell field)에서 보호 특성이 방출되는 세포외 소포체에서 비롯된다는 사실이 밝혀졌습니다. 우리는 이러한 소포의 내용물을 더 깊이 탐구하고 프리온 유발 신경교 염증에 대한 보호를 제공하는 방법을 이해하는 것을 목표로 합니다. 현재 신경 퇴행 분야에서는 신경 염증을 멈추는 데 성공한 몇 가지 방법이 있습니다.여기에는 소분자와 아데노 또는 렌티바이러스를 사용한 유전자 조절이 포함됩니다. 그러나 어느 것도 특히 뇌의 넓은 영역에서 염증을 완전히 줄일 수 없었습니다. 우리가 확립할 수 있었던 가장 중요한 발견은 세포 치료를 통해 신경교 염증을 억제하여 프리온 질환의 진행을 늦출 수 있다는 것입니다.질병의 일차 신경교세포 모델과 결합한 연구를 사용하면 신경 보호에 중요한 세포 스트레스 경로에 대해 계속 질문할 수 있으며, 이는 단독으로 생체 내 모델을 사용하는 것보다 더 효율적이고 직접적인 문제입니다.

adipose-derived-mesenchymal-stromal-cells-co-cultured-with-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells Co-Cultured with Primary Mixed Glia to Reduce Prion-Induced Inflammation

313 조회수.  Colorado State University. 우리의 연구는 뇌의 프리온 단백질이 잘못 접혀서 발생하는 치명적인 신경 퇴행성 질환인 프리온 질환에 초점을 맞추고 있습니다. 신경교세포가 신경세포 사멸에 미치는 영향에 초점을 맞춘 연구는 거의 없습니다. 우리는 신경교세포로 인한 염증을 멈추는 것이 치료적 접근법이 될 수 있는지 이해하고자 합니다.최근 중간엽 기질 세포 분야(mesenchymal stromal cell field)에서 ...

비디오: 저자 스포트라이트: 프리온 질환 연구의 발전에 대한 통찰력

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are potent regulators of inflammation through the production of anti-inflammatory cytokines, chemokines, and growth factors. These cells show an ability to regulate neuroinflammation in the context of neurodegenerative diseases such as prion disease and other protein misfolding disorders. Prion diseases can be sporadic, acquired, or genetic; they can result from the misfolding and aggregation of the prion protein in the brain. These diseases are invariably fatal, with no available treatments.
One of the earliest signs of disease is the activation of astrocytes and microglia and associated inflammation, which occurs prior to detectable prion aggregation and neuronal loss; thus, the anti-inflammatory and regulatory properties of MSCs can be harvested to treat astrogliosis in prion disease. Recently, we showed that adipose-derived MSCs (AdMSCs) co-cultured with BV2 cells or primary mixed glia reduce prion-induced inflammation through paracrine signaling. This paper describes a reliable treatment using stimulated AdMSCs to decrease prion-induced inflammation.
A heterozygous population of AdMSCs can easily be isolated from murine adipose tissue and expanded in culture. Stimulating these cells with inflammatory cytokines enhances their ability to both migrate toward prion-infected brain homogenate and produce anti-inflammatory modulators in response. Together, these techniques can be used to investigate the therapeutic potential of MSCs on prion infection and can be adapted for other protein misfolding and neuroinflammatory diseases.

Adipose-derived mesenchymal stromal cells (AdMSCs) have potent immunomodulatory properties useful for treating diseases associated with inflammation. We demonstrate how to isolate and culture murine AdMSCs and primary mixed glia, stimulate AdMSCs to upregulate anti-inflammatory genes and growth factors, assess migration of AdMSCs, and co-culture AdMSCs with primary mixed prion-infected glia.

연구

신경과학

Isolating and Infecting Primary Cortical Mixed Glia with Prions

To begin, take the brain isolated from the euthanized mouse pups and place it in a three-centimeter Petri dish containing cold MEM with EBSS and 2X PSN. Under a dissecting scope, separate brain hemispheres, remove and discard the midbrain, hippocampus, and meninges. Place both cortical hemispheres in a 50-milliliter conical tube containing five milliliters of MEM EBSS with 2X PSN, and keep on ice.In a tissue culture hood, aspirate the media from the 50-milliliter conical tube using a pipette, leaving the cortical tissue pieces at the bottom. Add 10 milliliters of pre-warmed dissociation media with a coated glass pipette, and triturate the tissue 10 to 20 times. Transfer the suspension to a 50-milliliter beaker containing a small stir bar and place it on a stir plate.Then remove the beaker, set it at a 30-degree angle for three minutes to allow the tissue to settle, and transfer the cell suspension to a new 50-milliliter conical tube on ice. Centrifuge the 50-milliliter conical tube at 1000G for 10 minutes at four degrees Celsius. Replace the supernatant with glial growth medium and count the cells using a hemocytometer.Plate the cells at a density of one million in 10-centimeter cell culture-treated dishes and incubate for 24 hours. Then replace the media with fresh glial media and allow the cells to reach 100%confluence within two weeks before plating them for experimentation. Plate 100, 000 glial cells per well in six-well plates and allow them to reach 80%to 100%confluence for in vitro prion infection.Expose 20%diluted brain homogenates and PBS to ultraviolet light for 30 minutes. Aspirate the media from the Glia to be infected and add 1.5 to 2 milliliters of glial growth media with 0.1%normal or prion brain homogenate per well. After 72 hours, remove the media, wash the cells with PBS and add fresh glial growth media.Carefully aspirate the adipose tissue in approximately one milliliter of HBSS in 0.25%trypsin solution, using a serological pipette. Transfer the tissue to a four-centimeter Petri dish containing two milliliters of DMEM F-12 media with Dnase-1, collagenase and Dispase mixture. Then cut the adipose tissue into small pieces using scissors and incubate the mixture at 37 degrees Celsius for 1.5 hours.Transfer the tissue to a 50-milliliter conical tube, triturate the tissue, and pellet the stromal vascular fraction, which will appear red. After washing the pellet with sterile PBS and centrifuging for three minutes, resuspend the pellet in one milliliter of ADMSC media. Afterward, pipette the cell suspension through a 40-micrometer strainer into a sterile 50-milliliter conical tube, to remove non-dissociated tissue.Add nine milliliters of ADMSC media to a 10-centimeter cell culture-treated dish. Pipette the strained cell suspension into it and incubate at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide. Change the media the next day and passage the cells once they attain 80%to 90%confluency.After the cells have undergone two to three passages, resuspend them in three to 10 milliliters of media and count using a hemocytometer. Plate 100, 000 cells per well in six-well plates containing ADMSC media and incubate overnight, as shown earlier. The next day, prepare the ADMSC media for cytokine-stimulated cells with either 10 nanograms per milliliter of TNF-alpha or 200 nanograms per milliliter of IFN-gamma.Create ADMSC media with a final concentration of 0.1%prion-infected or normal brain homogenate for control samples. Aspirate the old media, add 1.5 milliliters of cytokine or brain homogenate-containing media into the corresponding wells in triplicate, and return plates to the incubator. Then wash the cells with PBS and isolate RNA by adding 350 microliters of lysis buffer with 1%beta-mercaptoethanol to each well.Remove cell lysates using a cell lifter and reverse transcribe 25 nanograms of RNA per sample and amplify complementary DNA. Plate BV2 microglia at 50, 000 cells per well or primary mixed glia at 100, 000 cells per well in a six-well plate. Treat BV2 cells with media containing 0.1%prion-infected or normal brain homogenate and incubate for 72 hours.Following incubation, wash the cells two times with PBS to remove the remaining brain homogenate. Add fresh media to the cells and return the plate to the incubator. To stimulate ADMCs, treat them with 10 nanograms per milliliter of TNF-alpha for 24 hours before co-culturing with BV2 or mixed glia.Wash the stimulated ADMCs with PBS three times and spin the ADMSC suspension as demonstrated earlier. Replace the media on BV2 cells or mixed glia with two milliliters per well of ADMSC media, and place inserts for six-well plates with a pore size of 0.4 micrometers into half of the wells. Add two milliliters of ADMSC media to each insert and add an additional two milliliters of media to wells that do not receive inserts.Upon pelleting, resuspend and counting the ADMCs, add 50, 000 to 100, 000 cells to each insert and incubate them. At the end of the incubation, remove and discard the inserts or replace them in a new six-well plate and wash the inserts twice with PBS. Add the buffer provided by the RNA isolation kit to the mixed glia or BV2 cells and scrape the wells.

Isolating and infecting Primary Cortical Mixed Glia with Prions(원발성 피질 혼합 신경교세포와 프리온 분리 및 감염)

Migration Assay of Murine Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells

Treat passage two AdMSCs with media containing 10 nanograms per milliliter of TNF alpha for 24 hours or without TNF alpha for unstimulated cells. After washing and incubating the cells in serum-free media for four hours, add 25, 000 AdMSCs to each insert and incubate for 24 hours at 37 degrees Celsius. Aspirate the contents of both well and insert, then wash twice with PBS leaving one milliliter of PBS in each well.Using forceps, remove the inserts one by one and gently but thoroughly wipe the top chamber with a cotton swab to remove unmigrated cells. Aspirate the remaining PBS and pipette 500 microliters of crystal violet solution to the well and the top chamber of the insert. Aspirate the crystal violet solution from the well and top chamber of the insert after one hour incubation.After washing and wiping the top chamber, place the insert in a new 24 well plate containing one milliliter of PBS. Using an inverted microscope with a camera, image four random areas towards the insert's center under a 10 times objective. Upload the images to the preferred image processing software and adjust the background for enhanced contrast with purple stained cells.CLIA infected with 22L showed increased mRNA expression for inflammatory markers CCL2, CCL5, and IL1 beta, and the astrocyte marker S100 beta compared to those treated with NBH. Coculturing with AdMSCs decreased expression of the inflammatory cytokines CCL2, CCL5, and IL1 beta, but not TNF alpha for both MBH and 22L infected cells. BV2s cocultured with AdMSCs showed a decrease in mRNA for the inflammatory markers IL1 beta, IL-6, TNF alpha, and the complement protein C1qa in both NBH and RML treated cells.Additionally, AdMSCs decreased the M1 microglia gene CD16 and increased the M2 microglia marker ARG-1. The in vitro migration assay suggested that AdMSCs showed significant migration toward media containing 1%RML.