Для начала растворите порошок нильского красного в ацетоне в концентрации три миллиграмм на миллилитр. Инкубируйте раствор в течение 15 минут при комнатной температуре с периодическим перемешиванием. Отфильтруйте раствор с помощью фильтра толщиной 0,22 микрометра один или два раза в зависимости от количества осадка, оставшегося в растворе.
Затем приготовьте рабочий раствор, разбавив исходный раствор в соотношении один к 500 в DPBS. Добавьте 200 микролитров рабочего раствора в ячейки параформальдегида и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре на защитном от света шейкере. После инкубации дважды промойте образцы DPBS, затем добавьте 200 микролитров DPBS и храните их при температуре четыре градуса Цельсия.
Для окрашивания BODIPY приготовьте концентрацию 3,8 миллимоляра, растворив BODIPY в безводном ДМСО. Затем приготовьте рабочий раствор, разбавив исходный раствор в соотношении один к 300 в DPBS. Добавьте 200 микролитров рабочего раствора BODIPY в ячейки RPE, фиксируемые параформальдегидом, и инкубируйте в течение ночи на коромысле при комнатной температуре.
На следующий день дважды промойте клетки DPBS и добавьте 200 микролитров DPBS перед хранением при четырех градусах Цельсия. Для иммуноокрашивания APOE приготовьте буферный раствор, объединив DPBS с 1% BSA, 0,5% Tween 20 и 0,5% Triton X-100. Блокируйте и пропеабилизируйте параформальдегид-фиксированные клетки РПЭ в 200 микролитрах буферного раствора в течение одного часа.
После инкубации добавьте в буферный раствор первичное антитело APPLE, разведенное в соотношении 1:100, и инкубируйте в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день дважды промойте образцы с помощью DPBS. Затем добавьте 200 микролитров раствора вторичного антитела, разведенного в соотношении один к 1000 в течение одного часа при комнатной температуре.
После инкубации дважды промойте клетки DPBS и добавьте 200 микролитров DPBS перед хранением при температуре четыре градуса Цельсия.
