С помощью конфокального микроскопа и объектива с 40-кратным увеличением создайте профиль сканирования с соответствующими флуоресцентными каналами для используемого липидного маркера. После настройки режима и каналов сбора данных оптимизируйте стратегию фокусировки, нажав на кнопку «Программный автофокус». Затем установите диапазон Z Stack на 20 микрон.
После этого оптимизируйте плитки и откройте просмотрщик для выбора положения плитки. Далее, используя метод пакетной обработки изображений, создайте максимальные проекции каждого стека Z с помощью метода расширенной глубины фокуса. Перед экспортом изображений установите значение «Нет» и убедитесь, что исходные данные проверены.
Полученное изображение представляет собой максимальную проекцию в оттенках серого TIFF только на флуоресцентный канал, выражающий липидный маркер. Определите изображения в формате TIFF, представляющие Nile Red, BODIPY или APOE, и переместите их в папку Images в каталоге с именем Nile Red, BODIPY или APOE, в зависимости от используемого метода. Откройте программное обеспечение для измерения липидных единиц.
На вкладке Прогноз выберите соответствующий каталог, щелкнув многоточие и перейдя к указанному каталогу. Убедитесь, что липидная единица правильно определила изображения, проверив запись класса. Нажмите «Прогнозировать», чтобы наблюдать за ходом выполнения задачи, затем с помощью инструмента «Анализ масок» выполните итерацию по сгенерированным маскам и введите количественный подсчет пороговых отложений липидов на изображениях масок.
Успешная дифференцировка и созревание РПЭ показали сливающийся монослой с пигментацией и полигональной морфологией. Напротив, неудачная дифференцировка показала кластеры умирающих клеток. На флуоресцентных изображениях отложения Nile Red и BODIPY выглядели как маленькие яркие круглые точки.
Отрицательный результат показывает неправильную сегментацию изображения, ошибочно принимая фоновую флуоресценцию за отложение, либо из-за слабого окрашивания, либо из-за высокой интенсивности фона. Показаны отложения APOE, различающиеся по размеру, форме и интенсивности сигнала и требующие оптимизации методов окрашивания и визуализации для минимизации вариаций.
