Посев и трансфекция клеток на сетках электронной микроскопии (ЭМ) для криотомографии

Чтобы начать посев клеток, подсчитайте клетки после их отделения с помощью механических или ферментативных методов. С помощью микропипетки добавьте рассчитанное количество клеток на лунку в шестилуночный планшет, содержащий предварительно подготовленные сетки электронной микроскопии, избегая при этом образования пузырьков. Следите за тем, чтобы поддерживать от 1,5 до 2,0 миллилитров клеточной суспензии на лунку.

Для трансфекции молекулярных клонов ВИЧ инкубируйте клетки в течение 16-24 часов при температуре 37 градусов Цельсия. Добавьте 50 микролитров бессывороточного DMEM и один микрограмм ДНК в чистую микроцентрифужную пробирку. Для каждого хорошо разведите три микролитра трансфекционного реагента в сыворотке крови DMEM в отдельной чистой микроцентрифужной пробирке.

Гомогенизируйте смесь отдельно с помощью микропипетки. Затем добавьте смесь реагентов для трансфекции в смесь ДНК с помощью микропипетки и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре. После этого добавьте по 100 микролитров реагента для трансфекции и капните смесь ДНК по каплям в каждую лунку прямо поверх сеток.

Замените питательную среду через 16-24 часа после трансфекции. Через 24 часа после фазы совместной трансфекции микроскопия и флуоресцентная микроскопия показали, что все сетки имели минимальные разрывы в слое углерода. Клетки как на фиктивных сетках, так и на совмещенных сетках содержали жизнеспособные клетки в нескольких квадратах сетки.