Этот метод делает криовизуализацию сверхвысокого разрешения возможной на целых биологических клетках для точной идентификации клеточных структур. Он также может использоваться в сочетании с другими модальностями как часть коррелятивного рабочего процесса визуализации. Основными преимуществами этого метода является то, что визуализация сверхвысокого разрешения может быть быстро выполнена в криогенных условиях с использованием обычных флуорофоров и относительно низких доз света.
CyroSIM является мощным инструментом, который дает представление о понимании динамики клеточной ультраструктуры в ответ на внутренние или внешние сигналы. Его применение включает в себя производство и развертывание вакцин, контроль качества, послепродажный надзор, разработку и оптимизацию антител, а также характеристику наночастиц. Маневрирование образцов в пределах криоступенчатой требует практики для обеспечения безопасности сети.
Также лучше всего ознакомиться с элементами управления в окне Cockpit перед сбором данных. Для начала снимите крышку с внешнего Дьюара криоступенчаты и залейте отфильтрованным жидким азотом до тех пор, пока он не заполнится примерно на четверть. Подождите, пока первоначальное кипение не спадет, прежде чем заливать больше и наполните сосуд примерно на две трети.
Осторожно замените крышку, отведя сопло в сторону от обработчика, когда жидкий азот выкипает. Как только жидкий азот перестанет выходить из выхода, поместите выходную трубу над ступенью Дьюара на криоступенчатую. Подключите источник питания, подключите USB-кабель и подключите внешний Dewar к рабочей области.
После подачи жидкого азота нажмите кнопку разблокировки на криоступенчатой ступени, чтобы он вошел в камеру для отбора проб, и подождите от 30 до 45 минут, пока система остынет и стабилизируется, прежде чем приступать к сбору изображения. Используйте шестигранную клавишу на кассетном инструменте, чтобы открыть две пластины кассеты для передачи образцов. Открывайте пластины достаточно широко, чтобы опустить сетку между двумя пластинами, но не открывайте в максимальное положение.
Используйте длинные щипцы, чтобы поднять коробку сетки образца из жидкого азота. Поверните его так, чтобы выемка выровняла с позицией хранения внутри сцены, и поместите ее на сцену. Используйте соответствующее устройство, чтобы открыть крышку ящика для хранения в правильном положении образца.
Используя перевернутые щипцы, снимите сетку ТЕА с держателя образца, погрузите ее в жидкий азот, обеспечив, чтобы сторона углеродной пленки была размещена таким образом, чтобы она в конечном итоге была обращена к цели на мосту для отбора проб, и опустили ее в положение в кассете для передачи проб. Закройте картридж для образцов с помощью шестигранного ключа на кассетном инструменте. Используйте магнитную точку на кассетном инструменте, чтобы поднять и установить картридж, содержащий сетку, на мостик образца.
Держите его погруженным или близко к жидкому азоту и в правильной ориентации. Поместите кассету плоско в позиционирующие штифты моста и осторожно подтолкните ее, чтобы убедиться, что она закреплена. Закройте и извлеките ящик для хранения вместе со оставшимися образцами.
Переместите отверстие крышки криоступенчаты в положение визуализации и выключите свет камеры образца. Сдвиньте сцену к оптике, чтобы выровнять ее под объективом, затем осторожно опустите объектив в нужное положение с помощью рычага, убедив, что он лежит внутри крышки крио-сцены, но не касается ее. Накройте сцену и оптику непрозрачным черным занавесом, затем запустите программное обеспечение управления Cockpit на ПК cryoSIM. Нажмите кнопку режима считывания для каждой камеры и установите ее на CONV3 мегагерц.
Убедитесь, что температура каждой камеры составляет 80 градусов по Цельсию и что вентилятор камеры выключен. Включите отраженную камеру, при свете выберите окружающую среду и под linkam, проверьте конденсатор, затем нажмите кнопку видеорежима. В окне Представление мозаики уменьшите масштаб, чтобы увидеть контур сетки.
Нажмите «Найти сцену», если она не видна, и центрируете сетку, дважды щелкнув левой кнопкой мыши в середине круга. Используйте клавиши вверх и вниз, чтобы сфокусировать образец до тех пор, пока в фокусе не будет сфокусирована пленка поддержки сетки или любая другая соответствующая функция. Используйте девять и три клавиши на цифровой панели, чтобы изменить шаг Z.
Как только сцена будет центрирована, отключите режим видео. Соберите мозаику видимого света, щелкнув Run Mosaic в представлении мозаики, чтобы создать плитки изображений видимого света, которые спирально выходят наружу от центра. Сохраните представление, нажав кнопку Сохранить мозаику.
Осмотрите мозаику Bright-field вместе с любыми предыдущими изображениями флуоресцентной карты, отключив окружающий свет и конденсатор, а также видеорежим, затем включите необходимый лазер возбуждения и выберите соответствующую камеру и фильтр, первоначально со скоростью 50 милливатт в течение 50 миллисекунд экспозиции. Нажмите ноль, чтобы прикрепить изображение, и звездочку для автоматической контрастности. Кроме того, можно вручную настроить контрастность с помощью ползунка в нижней части изображения.
После того, как биологически интересные клетки с подходящей флуоресценцией были найдены, отметьте их положение с помощью кнопки «Пометить сайт» в представлении Mosaic. Продолжайте отмечать все потенциальные сайты перед началом получения изображений. Повторно сохраните мозаику с отмеченными сайтами, нажав на Кнопку Сохранить сайты в файл.
Чтобы сшить мозаичное изображение с помощью программного обеспечения stitchEm, перетащите файл текстовой мозаики в файл stitchEm с расширением BAT и сохраните объединенное TIF-изображение мозаичных плиток в той же папке. Чтобы сохранить изображение с отмеченными сайтами, перетащите текстовый файл мозаики и текстовый файл маркеров на значок одновременно. Установите время лазерной экспозиции на основе счетчиков и динамического диапазона в флуоресцентном изображении в нижней части окна обзора камеры.
Выберите, какой фильтр применять, и оптимизируйте настройки для каждой длины волны используемого света возбуждения, включив каждый лазер отдельно. Нажмите на обе камеры, чтобы включить их. Вернитесь на один из отмеченных участков и снова сосредоточьтесь на нужной глубине.
Оказавшись в фокусе в интересуемой области, выйдите из фокуса с помощью клавиши со стрелкой вверх в окне XY на макросхеме, чтобы выбрать высоту Z-стека для получения, и нажмите кнопку Сохранить сверху. Выйдите из фокуса с помощью клавиши со стрелкой вниз, нажмите «Сохранить внизу», затем на «Перейти к центру» убедитесь, что изображение все еще находится в фокусе. В окне Кабина выберите Эксперимент с одним сайтом.
В раскрывающемся списке выберите Структурированное освещение. Измените высоту стека так, чтобы она равняется высоте Z плюс один микрометр. Введите время экспозиции в миллисекундах для 405 и 488 нанометровых лазеров в верхнем ряду для отраженной камеры и время экспозиции для 561 и 647 нанометровых лазеров в нижнем ряду для передаваемой камеры.
Введите имя файла и нажмите «Обновить», чтобы создать новый файл, содержащий дату и время, не переопределяя предыдущие файлы, затем нажмите «Пуск». Если жидкий азот Дьюара заправляет криоступенчатую стадию во время получения изображения, прервайте процесс, нажав на кнопку ABORT в программном обеспечении Cockpit. В каждом положении соберите Z-стек, используя видимый свет, выключив лазеры и включив окружающий свет и конденсатор.
В разделе Эксперимент с одним сайтом выберите Z-стек и установите экспозицию окружающего света на 20 миллисекунд, сохраняя высоту Z. Повторите этот процесс для всех помеченных сайтов. После завершения визуализации отстыкуйте этап и удалите все образцы.
Выключите свет камеры для отбора проб. Отключите внешний Дьюар и декантируем оставшийся жидкий азот в другой криосовместимый контейнер, что позволит Дьюаку безопасно вернуться к нормальной температуре. Подождите, пока опция выпекания крио-сценического дисплея станет доступной после того, как на стадии Дьюара больше не останется жидкого азота.
Нажмите кнопку выпекания, чтобы принять режим нагрева. Поместите заглушку крышки на крио-сцену. Разрешение в криоСИМ значительно выше, чем в стандартной эпифлуоресцентной микроскопии.
Флуоресцентная карта с помощью обычного эпифлуоресцентного микроскопа может быть использована для определения местоположения областей, представляющих интерес для визуализации, а соответствующее изображение cryoSIM может быть получено из места на сетке. Образец, содержащий клетки U2OS, окрашивали смесью зеленого микротрубочка цитоскелетного красителя и красного красителя митохондрий, что приводило к окрашиванию компонента микротрубочек цитоскелета и митохондрий. Последующая визуализация показала локализацию митохондрий внутри клетки, а также расположение микротрубочек, подчеркнув структурный каркас, который они обеспечивают клетке, и сборку цитоскелета вокруг органелл.
Процесс реконструкции SIM-карты может создавать артефакты, которые могут быть идентифицированы с помощью SIMCheck, бесплатного плагина imageJ. Эта контрастная карта модуляции, сгенерированная с помощью SIMCheck, показывает области с низкой контрастностью модуляции в области ядра, что указывает на то, что эта область будет более восприимчива к артефактам реконструкции. Белая стрелка указывает на артефакт реконструкции.
При попытке этого протокола убедитесь, что образец всегда остается погруженным или близким к жидкому азоту, чтобы избежать девиттрификации. Также обратите внимание на время экспозиции и количество в динамическом диапазоне, так как это влияет на качество данных и позволяет избежать лазерного повреждения образца. После криовизуализации те же образцы могут быть визуализированы с помощью других методов, таких как криомягтерная рентгеновская томография, которую мы имеем здесь, в B24 Beamline.
Комбинируя изображения cryoSIM с изображениями, содержащими структурную информацию о клетке, мы можем ответить на ключевые дополнительные вопросы о клеточной ультраструктуре и функции.
