Недавно разработанные синхротронные рентгеновские флуоресценции нано-зонды позволяют визуализировать элементарное распределение образца. Использование криогенных подходов является обязательным для замедления рентгеновских повреждений излучения. Таким образом, быстрая криофиксация необходима для получения замороженных гидратированных клеток для оптимизации сохранения структуры клетки и ее химической целостности.
Специфика клеточных препаратов для синхротронных исследований приводит к оптимизации этого протокола для приобретения замороженных гидратированных монослой клеток. Визуальная демонстрация важна для понимания того, как манипулировать образцами монослойных клеток для достижения воспроизводимо криофиксированных клеток, встроенных в тонкий слой льда. Чтобы подготовить поддержку мембраны нитрида кремния, откройте капсулу, содержащую мембранную поддержку, и аккуратно сожмите капсулу, чтобы слегка ослабить поддержку.
Используйте тонкие пинцеты, чтобы схватить один угол кремниевой рамы, заботясь, чтобы не коснуться кремниевой нитридной мембраны в центре рамы и поместить рамку в нераскрытую чашку Петри в шкафу ламинарного потока. Затем УФ стерилизовать мембрану в течение 25 до 30 минут. В конце стерилизации добавьте 10 микролитров фактора крепления, таких как поли-L-лизин.
Инкубировать в течение 25 минут при 37 градусах по Цельсию и при 5%углекислом газе с влажностью. Затем заполните колодцы стерильной 48-колодец пластины с 200 до 250 микролитров 0,22 микрометра фильтруется ультра чистой и ультра след воды на скважину. Используйте тонкие пинцеты, чтобы тщательно погрузить мембрану вертикально с тремя последовательными 10-секундные полоскания в одном колодец воды.
После полоскания поместите мембрану вертикально в пустой колодец стерильной пластины 96-хорошо под капотом ламинарного потока и оставьте его на ночь до высыхания. Для посева клеток, представляющих интерес, поместите покрытие мембраны с плоской стороны лицом вверх в один колодец стерильной четырех-хорошо пластины. Добавьте пять раз 10 к четырем клеткам в 10 микролитров соответствующей культурной среды к поверхности мембраны нитрида кремния, не касаясь мембраны.
Капля должна покрывать всю мембрану. Затем культуры клеток на 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа с влажностью. Когда клетки начали прикрепляться к субстрату, медленно добавляйте один миллилитр полной культуры среды вниз по стене каждого хорошо, покрывая каждую мембрану.
Затем культуры клеток на 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа с влажностью. Для криоиммобилизации клеточной подготовки, сначала включите автоматический морозильник погружения и заполнить соответствующее количество скважин в 12-хорошо пластиковой пластины с 37 градусов по Цельсию ацетат буфера. Непосредственно перед полоскать и окунуться замораживания мембраны, удалить образец из инкубатора и использовать черный зажим кольцо пары быстрого выпуска пинцета, чтобы разблокировать пинцет.
Используйте разблокированный пинцет, чтобы схватить мембранную поддержку и погрузить мембрану вертикально в буферный раствор ацетата аммония в течение примерно пяти секунд. Чтобы удалить излишки буфера, нажмите нижнюю часть мембранной поддержки на фильтровальную бумагу и промокните каждую сторону кадра на фильтровальную бумагу, не позволяя мембране прикоснуться к бумаге. Когда избыточный буфер был удален, откройте дверь экологической камеры, быстро сдвиньте пинцет в типс блокировки, и закрыть дверь камеры.
Пресс пятно окунуться. Пинцет, держащий кремниевую нитридную мембрану, будет быстро погружен в криоген. После погружения замораживания снимите крышку контейнера с предварительно охлажденными типсами и нажмите передачу.
Силиконовая нитридная мембрана будет перемещена немного выше криогена. В быстром одном движении, слайд и слегка наклонить пинцет из типса блокировки довести пинцет непосредственно в пустой слот криокам в контейнере передачи заполнены азотной жидкостью. Затем отпустите черное кольцо зажима, чтобы освободить мембрану.
Для замораживания сушки замороженных клеток используйте выключатель рокера, расположенный на задней панели инструмента замораживания сушки, для питания прибора. Дисплей будет отображаться нажмите введите, когда готовы к загрузке образца. Намонтировать держатель латуни нитридной мембраны кремния поверх держателя передачи образца, предоставленного поставщиком в контейнере для хранения полистирола, сохраняя уровень жидкого азота примерно на один-два миллиметра ниже верхнего края первого латунного куска.
Поместите мембрану с стороны образца клетки лицом вверх в латуни держатель пронумеровав полость и предварительно охладить передачи стержня в жидком азоте заполненные полистирол пены поле. Используйте стержень, чтобы зафиксировать полную сборку, нажмите введите, чтобы сломать вакуум, чтобы освободить крышку камеры сушилки замораживания, немедленно передать образец в камеру сушилки замораживания, и закрыть крышку камеры сушилки замораживания. Затем немедленно нажмите начать продолжать цикл замораживания сушки.
В конце цикла замораживания сушки нажмите стоп, чтобы выпустить камеру и удалить полную сборку, чтобы получить доступ к лиофилизированным образцам. Здесь типичный оптический видео микроскоп зрения замороженных гидратированных клеток рака молочной железы линии клеток субкультуры на поли-L-лизин покрытием кремния нитрид мембраны поддержки, как показано на фото. Рентгеновское флуоресцентное элементарное картирование замороженных гидратированных клеток показывает распределение физиологических элементов, таких как калий, сера и цинк.
В этом репрезентативном примере плотно связанный элемент серы равномерно распределялся внутри клетки по аналогичной схеме, наблюдаемой для калия, и представляет собой хорошую оценку профиля клеточной массы. Распределение цинка, однако, продемонстрировали более высокий сигнал в ядре, чем в цитозоле с четко определенным разделением сигнала между цитозолом и ядром. В этой типичной Брайтфилд микроскопии зрения лиофилизированных первичных гиппокампа нейронов мыши непосредственно культурируется на кремниевой нитридной мембраны, как попродемонстрировано, клетки демонстрируют типичные нейронной морфологии, которая не зависит от их культуры или сохранения метода.
Рентгеновская флуоресценция изображения окунуться замороженных клеток также показывает типичные элементарные распределения, как выставлены эти представительные лиофилизированных клеток на 50 до 100 нанометров пространственного разрешения. Построение кремниевого нитридного окна имеет решающее значение для получения тончайшего ледяного слоя клеток после погружения замораживания. Сохранение химической целостности клеток на субклеточном уровне позволяет исследовать металлом клеток с помощью синхротронных нано-зондов, а также с помощью других микроаналитических методов.
Поскольку не все синхротронные нано-зонды анализ может быть выполнен при криогенной температуре, замороженные гидратированные клетки могут быть дополнительно лиофилизированных для облегчения их анализа при комнатной температуре. Не забудьте использовать соответствующее средства индивидуальной защиты при работе с жидким азотом и всегда использовать этотн газа в дымовой капот от пламени.
