Подготовка полнослойных скин-эквивалентов для 3D мультикультуры

Для начала смешайте воду, в 10 раз концентрированный PBS, и один моляр гидроксида натрия в пробирке. Затем пипеткой нанесите 500 микролитров достаточно плотных растворов дермальных клеток в двухмиллилитровую пробирку. Центрифугируйте раствор при 300г в течение трех минут при комнатной температуре.

После завершения центрифугирования выведите надосадочную жидкость пипеткой и аккуратно восстановите клетки в смеси воды, PBS и гидроксида натрия. Теперь добавьте в смесь 200 микролитров раствора коллагена. Пипеткой в суспензию хорошо перемешайте.

Далее пипеткой пипетку 500 микролитров приготовленной смеси во вкладыш в 24 луночной пластине. Для модели без рогового слоя пипеткой нужно накачать пипеткой 500 микролитров смеси в лунку без вставки. После инкубации тарелки в течение 10 минут при комнатной температуре перенесите ее в инкубатор на 30 минут.

Пипеткой 500 микролитров PBS буферизуется в каждую лунку для промывки гидрогелевой поверхности. Далее смешайте 200 микролитров суспензии кератиноцитов с равным объемом суспензии меланоцитов в дополненной среде DMEM. Аккуратно нанесите пипеткой 500 микролитров всей клеточной суспензии в каждую лунку.

Инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух-пяти дней. Заменяйте среду каждые 48 часов и используйте оптический микроскоп для наблюдения за ростом клеток. Была создана эквивалентная 3D-модель с различимой дермой и эпидермисом, которую можно было контролировать в режиме реального времени.

Наблюдались кератиноциты на разных стадиях роста клеток, которые являются показателями живого эквивалента. Также были замечены тучные клетки с узнаваемыми гранулами.