Для начала выберите среду для роста нематоды или пластину NGM, занятую истощенными личинками стадии L1 Caenorhabditis elegans. Используя один миллилитр стерильной воды, аккуратно смойте червей с тарелки. Аквотируйте примерно 300 микролитров популяции червей на планшеты NGM, засеянные концентрированным OP50.
Дайте пластинам высохнуть с помощью сушилки для тарелок или горелки Бунзена, а затем инкубируйте при температуре 20 градусов Цельсия, пока значительная популяция не станет взрослой особью. Чтобы собрать червей, смойте их с тарелки до 10 миллилитров стерильной воды и переложите теплую водную смесь в 15-миллилитровую коническую трубку. Дайте червям под действием силы тяжести осесть на дне трубки в течение примерно четырех минут.
С помощью небольшого наконечника для пипетки осторожно аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость. Затем добавьте до 15 миллилитров стерильной воды. После окончательной стирки удалите надосадочную жидкость и добавьте пять миллилитров свежеприготовленного раствора хлорной извести и гидроксида натрия.
Инкубируйте червей в течение пяти минут при комнатной температуре, делая это каждую минуту в течение не менее 10 секунд. Следите за ходом работы с помощью препарирующего микроскопа. Как только все взрослые особи раскроются или растворятся, добавьте буфер M9 для нейтрализации реакции, доведя итоговый объем до 15 миллилитров.
Затем центрифугируйте пробирку в течение двух минут при 1,300 G. Промойте яйца еще два раза 13 миллилитров буфера M9 с помощью центрифугирования, а затем однократно промойте 15 миллилитров полного буфера S. Затем центрифугируйте яйцеклетки в течение двух минут при 1,300 G. После центрифугирования отасуньте надосадочную жидкость и добавьте 10 миллилитров полного буфера S. Аккуратно вращайте трубку при комнатной температуре в течение ночи с помощью мутатора или аналогичного устройства.
С помощью препарирующего микроскопа оцените, вылупились ли черви. Подсчитайте червей в 10-микролитровых каплях S-буфера под микроскопом. Приготовьте жидкую червячную смесь из 60 червей на миллилитр в полной среде S, содержащей карбенициллин, амфотерицин В и OP50.
Добавьте 120 микролитров среды с червями в ряды от A до G и без червей среды в ряд H. Затем запечатайте пластину уплотнителем для ленты, чтобы предотвратить загрязнение и испарение. Инкубируйте герметичные планшеты в течение примерно 65 часов при температуре 20 градусов Цельсия, пока животные не станут червями L4. Добавьте 30 микролитров 0,6-миллимолярного раствора фтордезоксиуридина в каждую лунку для стерилизации животных на стадии L4.
Повторно запечатайте пластину с помощью ленточных запайщиков и перемешивайте ее в течение 20 минут при 800 об/мин на встряхивателе для пластин с микротитротом. Верните пластины в инкубатор с температурой 20 градусов Цельсия. На следующий день добавьте интересующий препарат к культуре первого дня.
Запечатайте пластины с помощью скотча и встряхивайте в течение 20 минут при 800 об/мин на встряхивателе для пластин. Затем, сняв крышку и защитную пленку, измерьте внешний диаметр 600 в считывателе пластин для измерения в первый день. Снова закройте и верните пластины в инкубатор с температурой 20 градусов Цельсия.
Используя инвертированный микроскоп, желательно с двукратным объективом, подсчитайте популяцию червей в каждой лунке и запишите цифры в электронную таблицу. После подсчета верните пластины в инкубатор с температурой 20 градусов по Цельсию. Кривая зависимости от дозы и реакции на полное изменение потребления пищи в зависимости от концентрации серотонина показала, что штамм N2 может переедать дозозависимым образом.
Мутант daf-16 mu86 демонстрирует более высокое базальное питание, чем N2. Однако он не может реагировать на серотонин таким же дозозависимым образом, как штамм N2. Значительная разница наблюдалась в потреблении пищи червями, получавшими лечение локсапином, но с бактериями, убитыми рентгеновскими лучами, гамма-лучами или параформальдегидом. Сравнение потребления пищи рядом генетических штаммов показало, что мутанты exc-4 и cgr-1 едят меньше, в то время как мутанты srp-6 едят больше.
