Был принят простой подход к мониторингу изменений в протеостазе путем оценки агрегации полиглутамина и предоставления структуры, которая может быть использована для приложений с высокой пропускной способностью. Оценка фенотипа, такого как количество агрегатов по I, может стать субъективной. Автоматизация подсчета агрегатов позволяет устранить такую предвзятость, увеличить пропускную способность и воспроизводимость.
Этот метод помогает идентифицировать бактериальные гены, способствующие нарушению протеостаза хозяина. Понимание вклада отдельных бактериальных генов поможет нам понять его значение в патогенезе таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера, Паркинсона и Хантингтона. Начните с удаления пластин, содержащих червей, из морозильной камеры и дайте им оттаять при комнатной температуре.
Затем протрите лишнюю конденсацию и снимите крышку перед визуализацией. Используйте настройки микроскопа со временем экспозиции 500 миллисекунд, увеличением 40 X с адаптером камеры 0,63 X и интенсивностью GFP, установленной на 100% во время захвата изображения. Теперь отрегулируйте элементы управления проходящим светом до тех пор, пока черви не окажутся ярко освещенными по сравнению с темным фоном, избегая передержки.
Измените положение червей внутри скважины, чтобы предотвратить чрезмерное слипание, используя наконечник пипетки 10 микролитров, чтобы осторожно подтолкнуть червей в нужное положение. Установите для канала фильтр GFP для создания фокальной плоскости для обоих изображений. Захват изображения яркого поля.
Сделайте соответствующее флуоресцентное изображение, не нарушая пластину и не изменяя фокус микроскопа. Теперь, чтобы оценить изображения, сначала загрузите CellProfiler. Откройте программное обеспечение и перетащите интересующие изображения в поле изображений.
Нажмите на изображения в списке файлов, чтобы открыть их. Выберите лупу, чтобы выделить интересующую область, и значок стрелки, чтобы измерить длину червей и агрегатов. Наведите курсор на нужный объект, чтобы определить его значение интенсивности, которое можно увидеть в нижней части экрана.
Чтобы использовать конвейер анализа изображений CellProfiler, назовите пары изображений правильно, как описано в текстовой рукописи после загрузки CellProfiler с официального сайта. Загрузите конвейер и загрузите его в CellProfiler, выбрав файл, импорт и конвейер из файла. Выберите модуль «Распутанные черви», чтобы открыть его настройки для загрузки обучающего набора, используемого для идентификации червей в модуле «Распутанные черви».
Затем определите имя файла обучающего набора. Выберите значок загрузки файла и загрузите дополнительный файл. Загрузите изображения, выбрав модуль изображений в левом верхнем углу.
А затем перетащите правильно названные изображения. Перед анализом изображений выберите нужную выходную папку, которая будет использоваться для хранения результатов, нажав на кнопку настроек вывода, расположенную в левом нижнем углу программы. Затем выберите значок папки справа от выходных данных по умолчанию, чтобы выбрать желаемое местоположение вывода.
Выберите значок анализа изображений, чтобы начать анализ изображений. Если анализ занимает слишком много времени и застрял, обрабатывая одно изображение, прервите запуск и определите необработанное изображение, отсортировав выходную папку и отметив, какое имя изображения не найдено. После полного анализа программное обеспечение организует результаты в электронную таблицу Excel, содержащую отдельных червей в столбце N, и соответствующее количество агрегатов в столбце K.Загрузите организатор метаданных, чтобы удобно организовать данные из выходного CSV-файла из CellProfiler.
Для ОС Windows найдите загруженный файл и извлеките его в нужное место. Найдите и откройте извлеченную папку с именем gui_Windowsos_64x. И запустите приложение, нажав на значок приложения с графическим интерфейсом.
Может открыться запрос на получение разрешения на запуск. Выберите дополнительную информацию, а затем нажмите «Запустить» в любом случае. Организатор метаданных теперь готов к перетаскиванию выходных CSV-файлов CellProfiler.
Для Mac OS найдите загруженный файл и извлеките файл приложения организатора метаданных файла. Откройте извлеченную папку, найденную в загрузках. Щелкните правой кнопкой мыши на графическом интерфейсе приложения и выберите Открыть.
Появится запрос на разрешение на открытие из-за отсутствия официальной лицензии. Выберите Открыть. Как только ваше приложение организатора метаданных будет открыто в соответствующей ОС, нажмите «Загрузить файлы здесь» или перетащите нужные CSV-файлы CellProfiler.
Нажмите на кнопку упорядочить, которая приведет пользователя на новый экран с кнопкой загрузки файлов. Нажмите на кнопку и выберите нужное место для сохранения выходного файла. Выходной файл будет отображаться как исходное имя файла с расширением _organized, добавленным к имени файла.
В присутствии FUDR черви, которых кормили различными бактериями, имели более последовательный размер тела, что позволяло более равномерно и точно обнаруживать червей, тем самым решая проблему переполненности. Замораживание червей улучшило обнаружение агрегатов polyQ за счет устранения фоновой флуоресценции, а также точность автоматического подсчета, сопоставимую с ручным подсчетом. Инвертированное яркое освещение использовалось для обнаружения всего канала C.elegans и GFP для изображения агрегатов polyQ YFP.
Обнаружение, распутывание червей и агрегированная количественная оценка для каждого червя были выполнены путем применения оптимизированного конвейера обработки изображений CellProfiler, который позволяет получить количество агрегатов на одного отдельного червя. Разница между эффективностью автоматизированной агрегированной количественной оценки и использованием конвейера CellProfiler была минимальной, что указывает на то, что автоматизированный метод может быть применен к крупномасштабным экранам. Из 90 протестированных бактериальных штаммов колонизация кишечника C.elegans одним кандидатом показала значительное снижение количества агрегатов.
Эксперименты по подтверждению методом ручного подсчета показали, что ни один из мутантов, включая того, который значительно уменьшил количество агрегатов, не повлиял на агрегацию polyQ. Исследователи, решившие использовать эту структуру, должны понимать, что описанные шаги не являются абсолютными. Модификация и фундаментальное понимание того, как манипулировать CellProfiler, необходимы для успеха.
Дополнительные биохимические подходы, такие как вестерн-блоттинг, могут быть использованы для подтверждения агрегации polyQ.
