Чтобы получить суспензию одиночных клеток из изолированного нейронного мозга, поместите мозг в предварительно охлажденный 15-миллилитровый стеклянный гомогенизатор Dounce, содержащий соответствующее количество ледяного сбалансированного раствора соли Хэнкса или буфера HBSS. Используйте свободный пестик Dounce, чтобы мягко и медленно диссоциировать мозговую ткань примерно 100-120 ударами по льду. Полученную суспензию мозговой ткани профильтровать через клеточный фильтр толщиной 70 микрон в центрифужной пробирке объемом 50 миллилитров.
Промойте пробирку Dounce пятью миллилитрами HBSS и приступайте к фильтрации, чтобы максимально увеличить сбор клеток. Центрифугируйте отфильтрованную тканевую суспензию при 550 г в течение шести минут при четырех градусах Цельсия. Удалите надосадочную жидкость с помощью вакуумного аспиратора и повторно суспендируйте небо клетки в одном миллилитре 30% изотонического раствора градиента плотности.
Переложите клеточную суспензию в 15-миллилитровую центрифужную пробирку. Добавьте соответствующее количество раствора с градиентом плотности 30% и аккуратно переверните трубку, чтобы обеспечить тщательное перемешивание. Немедленно центрифугируйте трубку при 845 g с ускорением и тормозом, установленным на третьем уровне, в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия.
После этого аккуратно извлеките пробирку из центрифуги, не встряхивая, и осторожно отсасывайте верхний слой миелина с помощью одномиллилитрового наконечника, подключенного к вакууму. Затем аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя от одного до двух миллилитров, и повторно суспендируйте небо клетки с помощью минимум 10 миллилитров холодного HBSS. Центрифугируйте при 550 г в течение шести минут при четырех градусах Цельсия.
Промойте еще один раз минимум семью миллилитрами холодного HBSS, и снова центрифугируйте. После удаления как можно большего количества надосадочной жидкости ресуспендируйте клетки в 100-200 микролитрах буфера для проточной цитометрии для анализа проточной цитометрии.
