Конструирование sgRNA и создание вектора для редактирования генома для селекции риса с резистентным крахмалом

Для начала перейдите на веб-сайт NCBI, чтобы получить необходимый ген от сорта японского риса. Загрузите и получите доступ к референсному геному в программном обеспечении SNAP gene. Проанализируйте вставки или делеции, а также однонуклеотидные полиморфизмы в последовательности экзона O-S-S-B-E 2B из разновидности X134, сравнивая ее с референсным геномом.

с помощью инструмента NCBI для струйной обработки грунтовки, спроектируйте грунтовки, фланкирующие области экзонов. Для валидации экзонной последовательности гена O-S-B-E 2B в X134 методом секвенирования по Сэнгеру подготовьте реакцию и запустите программу ПЦР с соответствующими настройками. Спроектируйте одиночную направляющую РНК, или S-G-R-N-A на последовательности экзона O-S-S-B-E 2B X134, придерживаясь протокола, и убедитесь, что последовательность протоспейсера, примыкающая к мотиву, равна TTN.

Добавьте CAC OLIGOS на пять основных концов переднего праймера и GGCC OLIGOS на пять основных концов обратного праймера. После растворения грунтовок смешайте по одному микролитру каждой грунтовки с восемью микролитрами отжигающего буфера. Поместите смесь в ПЦР-машину и запустите программу отжига.

Соберите S-G-R-N-A в вектор редактирования генома и запустите программу сборки ПЦР. Преобразуйте полученный вектор в клетки кишечной палочки и выполните ПЦР-амплификацию на отдельных колониях для скрининга успешных вставок и подтверждения успешного клонирования с помощью секвенирования по Сэнгеру.