Это исследование было поддержано грантами GM046406 (к БД) и Национального института общих медицинских наук Центра биологии Количественный (GM071508). RSM признает финансирование из NSF Высшее исследовательский грант. MNM поддерживается Льюиса Сиглера стипендий. Мы хотели бы выразить признательность членам Botstein лаборатории за полезные обсуждения и бывших членов Allegra Петти и Николай Славов за их вклад в метаболический цикл проекта. Мы благодарим Даниэля Zenklusen Роберт Зингер и для того, чтобы нас начали с рыбой методом.

На рисунках 1 и 2 представляют собой схематические FISH экспериментальных процедур и анализа изображений трубопровод использовали для количественной FISH изображений. 1. Решения по подготовке * Решения ниже для использования с певицей зондов. При использовании зондов Stellaris заменить &quot;40% формамидом&quot; на &quot;10% формамидом&quot; в обоих буфера гибридизации и отмывки буфером. Дополнительные изменения в буфере для гибридизации при использовании Stellaris зонды (1) добавить 1 г декстрансульфате и (2) не включают 10 мг одноцепочечной ДНК. Буфер В 8 мл 1 М KH 2 PO 4 41,5 мл 1 М К 2 НРО 4 109,3 г сорбита Сферопластов буфера 890 мкл буфера B 100 мкл VRC 10 мкл 25 000 Ед / мл Lyticase 2 мкл β-меркаптоэтанол &lt;сильный буфера гибридизации&gt; (10 мл, конечный объем) 10 мг E. палочка тРНК 10 мг * одноцепочечной ДНК 100 мкл 200 мМ VRC складе 40 мкл 50 мг / мл BSA 1 мл 20 х SSC 4 мл 40% формамида * Нуклеазы бесплатно Вода (до 10 мл конечного объема) 1 г декстрансульфате * * Гибридизации буфер может храниться в 0,5 мл аликвотах при -20 ° C для удобства. Промывочный буфер (50 мл, конечный объем) 5 мл 20 х SSC 20 мл 40% формамида * Нуклеазы бесплатно воде (50 мл конечного объема) Маркировка буфера 1,06 г карбоната натрия 100 мл воды DEPC рН 9 2. Зонд-маркировки (Singer только для датчиков) Мы получим эти зонды в доме синтеза с использованием синтеза олигонуклеотидных ABI аппарата. Typicсоюзник, 4-5 ~ 50 п.н. олигонуклеотиды синтезируют, которые гомологичны представляющий интерес ген, заменяя амино-аллил тимидина в течение нескольких тимидина расстоянии не менее 8, предпочтительно от 10 + пар друг от друга. Из-за их чувствительность к озону, мы работаем в безозоновом объекта при использовании CY красителей. <ol><li> Получаем ~ 5 зондов и ресуспендируют в 100 мкл воды - проверка концентрации на Nanodrop. </li><li> В зависимости от того, сколько зондов / ген, объединить общей сложности 10 мкг олигонуклеотидов / ген (например, если есть 5 зондов / гена, то хотим 2 мкг / зонд). </li><li> Используйте QIAquick колонки для очистки зондов в соответствии с Протоколом QIAquick нуклеотидные комплект удаления. </li><li> Добавить 10 объемами буфера PN к общему объему комбинированных зондов и перемешать. </li><li> Нанести образец в колонку QIAquick - если общий объем больше 750 мкл, спин вниз дважды, используя половины объема в каждом вращении </li><li> Дайте постоять в течение 1 мин. </li><li> Центрифуга 1 мин при 6000 оборотах в минуту. </li><li> Промыть 750 мкл буфера PE. </li><li> Центрифуга1 мин при 6000 оборотах в минуту. </li><li> Утилизацию потока через и повторно ротационную колонку в течение 1 мин при 13000 оборотов в минуту, чтобы высохнуть. </li><li> Место QIAquick столбца в новую пробирку и микроцентрифужные элюата ДНК с 50 мкл H 2 O - Убедитесь, что H 2 O рН находится в пределах 7,0 и 8,5 и находится непосредственно на мембране. </li><li> Дайте постоять в течение 1 мин. </li><li> Центрифуга течение 1 мин при 13000 оборотов в минуту, чтобы элюировать ДНК. </li><li> Лиофильной сушке ДНК при 45 ° С. </li><li> Ресуспендируют гранул в 10 мкл буфера для маркировки и добавить в трубке красителя, не касаясь красителя. </li><li> Повторите с другой 10 мкл буфера для маркировки. </li><li> Vortex и спином вниз трубку краситель и ДНК. </li><li> Обложка трубы с алюминиевой фольгой и держать в темноте при комнатной температуре O / N на этикетке. </li><li> Повторите QIAquick нуклеотидные протокола Комплект удаления. Выполните с двумя отличиями: - Добавить 200 мкл буфера PN к зондам и положить меченых зондов через 2x столбцов. - Выполнить 3 промывок буфером PE для того, чтобы смыть любую одиноких красителя перед элюирования. </li><li> Звуковая частотаТер элюирования получить концентрацию через NanoDrop. Маркировки эффективности, как правило, ~ 0,25 пмоль / нг одноцепочечной ДНК. </li></ol> 3. Подготовка Покровное <ol><li> Место покровные на слайдах при плазменно-копчиковой вакуумной камере ( <a href="http://www.plasmapreen.com/" target="_blank">http://www.plasmapreen.com/</a> ) (ближе к центру, тем лучше). </li><li> Положить в вакуумной камере микроволновой печи и убедитесь, что она запечатана. </li><li> Включите насос первого затем включить только один раз вакуум насос. </li><li> Включите микроволновую печь, и остановка 5 сек после плазменной видна. </li><li> Отключите вакуумную затем насосом. </li><li> Вытяните вакуумной камере и удалите покровные щипцами (те, которые упали должны быть очищены снова). </li><li> Место покровные очищены вверх в 12-луночных планшетах. </li></ol> 4. Процедура фиксации <ol><li> Расти дрожжей OD 600 около 0,1-0,2 в минимальных средах. 10 мл клеток дает достаточно лR ~ 10 отдельных гибридизации. </li><li> Добавить 1/10 объема 37% формальдегида непосредственно в ростовой среде (10 мл культуры + 1 мл 37% формальдегида) и оставьте на 45 мин. </li><li> Вымойте 2x с 1 мл ледяного буфера B в микроцентрифужных трубку (может вращаться со скоростью 13000 оборотов в минуту в течение 1 мин). </li><li> Добавить 1 мл сферопластов буфера. </li><li> Инкубировать при 37 ° С в течение 15 мин. Проверьте клетки каждые несколько минут под микроскопом, пока большинство клеток не черный (т.е. не-фазы яркий). </li><li> Вымойте 2x ледяной буфера B, спиннинг на низкой скорости (~ 3500 оборотов в минуту). </li><li> Добавить 1 мл 70% этанола, ресуспендируйте мягко и оставить на ночь при 4 ° С (может хранить до бесконечности при -20 ° C). </li></ol> 5. Процедура Гибридизация <ol><li> Подготовьте раствор для гибридизации: к 100 мкл буфера для гибридизации, добавьте 1-3 мкл зонда, то вихрем и центрифуги. Певица зондов использовать 8-10 нг Всего за комплект зонда (т.е. на ген). Мы отображаемого до 3 генов одновременно с 3-DIFferent меченого зонда устанавливается. </li></ol> Будьте уверены, чтобы нагреть гибридизации раствора до комнатной температуры перед его открытием. Для Stellaris зонды, рекомендуется, чтобы начать 4 отдельных реакций гибридизации путем добавления 1 мкл каждого из 1:10, 1:20, 1:50 и 1:100 рабочего разведения зонды, какой из них является оптимальным. Рабочее разведений Stellaris зонды готовили в буфере для гибридизации. <ol start="2"><li> Центрифуга (для всех последующих шагов; 3500 оборотов в минуту, 5 мин) фиксированные клетки (например, 200 мкл) и аспирации от этанола. </li><li> Аккуратно ресуспендируйте в 1 мл промывочного буфера, содержащий те же формамидом процентах как буфера для гибридизации. Дайте постоять 2-5 мин. </li><li> Центрифуга образца и аспирация промывочного буфера, а затем добавить раствор для гибридизации. Инкубируют в темноте при осторожном встряхивании, O / N при 37 ° С. </li></ol> Примечание: Следующая процедура предназначена для применения / изображений на покровных клетках. Для Wозоления / изображений клеток в 96-луночных планшетах, включая альтернативные активных форм кислорода мусорщик решения см. <a href="http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols" target="_blank">http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols.</a> <ol start="5"><li> На следующий день, или заранее, в чистоте (см. процедуры) и лечения покровные стекла с 150 мкл 0,01% поли-L-лизин в течение 5 мин. Аспирируйте, дайте высохнуть, промыть 3 раза с ГД 2 O и дайте высохнуть. </li><li> Утром добавляют 1 мл промывочного буфера для образца, осторожно ресуспендируют, центрифуги и аспирации, а затем ресуспендируют в другой 1 мл промывочного буфера и инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин. </li><li> Промыть 2Х SSC + 0,1% Тритон Х-100 при комнатной температуре 15 минут на шейкере. </li><li> Возьмите монтажа средних из морозильника, чтобы позволить ему подойти к комнатной температуре до начала монтажа. </li><li> Промыть 1X SSC при комнатной температуре 15 мин на шейкере. </li><li> Развести DAPI в PBS (0,1 мкг / мл окончательный) и ресуспендирования клеток в 150 мкл. </li><li> Место решение на очищенную / поли-лиз-TreaТед покровные стекла в 12-луночный планшет, по крайней мере 30 минут спокойно. </li><li> Удалите раствор (вы можете поместить его на запасной покровного в качестве резервного) и промыть 3 раза с 1 мл 1X PBS. </li><li> Поместите 3 мкл Продли Золотой монтажа среды на слайд (Invitrogen P36934). Делайте это по одному за раз, если у вас есть несколько покровных, чтобы избежать высыхания монтажной среды. </li><li> Добавить ~ 0,5 мл этанола, покровное в 12-луночный планшет, удалите покровные и сухой воздух, удерживая с помощью пинцета. </li><li> Поместите клетки покровного стекла стороной вниз на монтажную среду и пусть затвердевают несколько часов или O / N в темноте. </li><li> Печать края с лаком для ногтей и приступить к визуализации. </li></ol> 6. Изображений клеток с Olympus IX-81 Перевернутый Обзор микроскоп <ol><li> Для получения изображения мы используем Slidebook (интеллигентного imaging.com) программного обеспечения и 100X, 1,45 Н.А., TIRFM нефти цели. Для последовательной GFP, DAPI, Cy3, Cy3.5 и Cy5 изображения: Chroma наборы фильтров (см. реагентов). </li><li> Используйте фильтры DAPIнайти и сосредоточиться клеток. </li><li> Установить в качестве точки отсчета. </li><li> Возьмите Z-стек изображений вокруг опорной точки, где общее расстояние составляет 5 мкм с размером 0,2 мкм (25 самолетов). Повторите эти действия для каждого канала красителя (т.е. каждый набор зондов). </li><li> Экспорт в 16-битные TIFF для анализа изображений. </li></ol> 7. Анализ изображения Обзор (Singer зонды) Ниже мы приводим схему вычислительных методов мы используем для анализа FISH изображения в MATLAB. Соответствующих функций MATLAB использованы в скобки справа. Алгоритмы и пороги сейчас настроены для данных с зондов Певица стиля. Использование зондов Stellaris стиль потребует некоторого регулировки, в частности, к конечной стадии фильтрации (7.8). Идентификации ячейки 15 <ol><li> Отдельные клетки от фона, используя глобальный порог на 16 DAPI изображения [graythresh]. </li><li> Определить ядер с использованием расширенных функций максимумов [IMextendedmax]. </li><li> Сегмент клеток с использованием ядер семян для водоразделе алгоритм [водоразделом]. </li></ol> Найти места в каждом канале флуоресценции <ol start="4"><li> Выполните TopHat преобразования для нормализации фона и улучшить отношение сигнал-шум [bwmorph]. </li><li> Найти максимумы для идентификации в фокусе слой (в плоскости г) для каждого пятна [imregionalmax]. </li><li> Фильтр потенциальных мест с использованием линейной модели подходят к радиальным градиентом. </li></ol> Измерение интенсивности месте и одним фильтром против нескольких сигналов зонда <ol start="7"><li> Fit 2D гауссовым профилем на место в ранее выявленных в фокусе слоя и оценку интенсивности 17. </li><li> Фильтр из слабых мест с использованием порогового уровня (по гистограмме). Для зондов Зингера это важно, но в меньшей степени для Stellaris зондов. </li><li> Граф пятна в каждой клетке. </li></ol>

<ol>
	<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280, 585-590 (1998).</li><li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+Detection+of+Rna-DNA+Hybrid+Molecules+in+Cytological+Preparations.">Formation and Detection of Rna-DNA Hybrid Molecules in Cytological Preparations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 63, 378 (1969).</li><li>Jones, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+and+Nuclear+Location+of+Mouse+Satellite+DNA+in+Individual+Cells.">Chromosomal and Nuclear Location of Mouse Satellite DNA in Individual Cells.</a> Nature. 225, 912 (1970).</li><li>Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+fluorescence+microscopical+localization+of+specific+DNA+sequences+by+in+situ+hybridization+of+fluorochromelabelled+RNA.">A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA.</a> Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).</li><li>Singer, R. H., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+gene+expression+visualized+in+chicken+muscle+tissue+culture+by+using+in+situ+hybridization+with+a+biotinated+nucleotide+analog.">Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7331-7335 (1982).</li><li>Silverman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+cycling+in+single+yeast+cells+from+unsynchronized+steady-state+populations+limited+on+glucose+or+phosphate.">Metabolic cycling in single yeast cells from unsynchronized steady-state populations limited on glucose or phosphate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6946-6951 (2010).</li><li>Trcek, T., Larson, D. R., Moldon, A., Query, C. C., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+mRNA+decay+measurements+reveal+promoter-+regulated+mRNA+stability+in+yeast.">Single-molecule mRNA decay measurements reveal promoter- regulated mRNA stability in yeast.</a> Cell. 147, 1484-1497 (2011).</li><li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol Cell. 2, 437-445 (1998).</li><li>Gandhi, S. J., Zenklusen, D., Lionnet, T., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+functionally+related+constitutive+genes+is+not+coordinated.">Transcription of functionally related constitutive genes is not coordinated.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 27-34 (2011).</li><li>Itzkovitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+transcript+counting+of+stem-cell+markers+in+the+mouse+intestine.">Single-molecule transcript counting of stem-cell markers in the mouse intestine.</a> Nature Cell Biology. 14, 106-U193 (2012).</li><li>Raj, A., Rifkin, S. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+in+gene+expression+underlies+incomplete+penetrance.">Variability in gene expression underlies incomplete penetrance.</a> Nature. 463, 913-U984 (2010).</li><li>Raj, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+individual+endogenous+RNA+transcripts+in+situ+using+multiple+singly+labeled+probes.">Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes.</a> Methods Enzymol. 472 (10), 365-386 (2010).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).</li><li>Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5, 877-879 (2008).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tlreshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Tlreshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man and Cybernetics. 9, 62-66 (1979).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes.">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).</li><li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast-acting+and+nearly+gratuitous+induction+of+gene+expression+and+protein+depletion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular biology of the cell. 22, 4447-4459 (2011).</li><li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling.">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nature Methods. 9, 743-U159 (2012).</li><li>Levsky, J. M., Shenoy, S. M., Pezo, R. C., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+profiling.">Single-cell gene expression profiling.</a> Science. 297, 836-840 (2002).</li><li>Wyart, M., Botstein, D., Wingreen, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Gene+Expression+Dynamics+Using+Pairwise+RNA+FISH+Data.">Evaluating Gene Expression Dynamics Using Pairwise RNA FISH Data.</a> Plos Computational Biology. 6, (2010).</li></ol>

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие между собой финансовые интересы.

На сегодняшний день, в первую очередь рыба была низкой пропускной методом. Использование Cy3, Cy3.5 и Cy5 красители ограничивает количество генов можно исследовать на отдельные клетки до трех одновременно. Некоторые дополнительные зонды были разработаны (Stellaris), но количество различимых зондов по-прежнему не более семи. Чтобы обойти это ограничение, комбинаторные маркировки стратегии с использованием нескольких флуорофоров были использованы для создания штрих-кодов для различных видов мРНК 19,20. Совсем недавно, Любек и Цай использоваться оптические и спектральные штриховое кодирование для количественной 32 различных видов одновременно с рыбой в одиночных клетках дрожжей 19. Один из недостатков этого недавнего комбинаторный подход требует использования сверхразрешения микроскопии. Анализ необходимо различать штрих зондов также довольно сложным. Мы обнаружили, что Cy3 и Cy3.5 предпочтительнее Cy5 для рыб экспериментов. Один из недостатков Cy5 краситель является его чувствительностьк фотообесцвечивания. Тем не менее, Stellaris недавно разработала Cy5 варианты, которые рекламируются как более устойчивы к фотообесцвечивания, и может облегчить это технический вопрос. Также стоит отметить, что рыба дорогая метод для реализации, и что обе певицы и Stellaris зондов обычно стоят $ 700 - $ 1000 за набор зондов, хотя цены на коммерчески доступных зонды должны уменьшаться в будущем. Щадящая реагентов и эффективной маркировки приносит Певица зондов до нижнего диапазона в цене. Одним из основных технических задач является разделение одного против нескольких зондов пятна, которые требует реализации сложных точечного определения алгоритмов. Это может занять обширный обзор руководства, чтобы настроить параметры анализа изображений для конкретных экспериментальных установок. Схема нашей вычислительной трубопровода с соответствующими функциями MATLAB приведена в разделе 7 Протокола. Этот вопрос несколько облегчены Stellaris пробы, которые обладают только<html> одна метка на зонде. Поэтому требуется колокализации несколькими зондами видеть сигнала. Поскольку FISH требует фиксации клеток, он не облегчает отслеживание отдельных клеток с течением времени. Ранее мы использовали данные FISH снимок реконструировать динамику экспрессии генов в отдельных метаболически Велоспорт дрожжей населения 6. Метаболический Велоспорт наблюдается в предварительно морили голодом, непрерывными культур, и характеризуется общепопуляционными коллективные колебания в потреблении кислорода. Эти колебания связаны с геном-широкие колебания, которые происходят стенограммы половина всех генов дрожжей на разных этапах потребления кислорода. Мы стремились, чтобы определить, метаболические Велоспорт присутствовал в несинхронизированную непрерывной культуры дрожжей. Если присутствует, стенограмм, которые антикоррелированы в синхронных групп населения также должны быть антикоррелированы несинхронизированную в одиночных камерах, и наоборот для коррелированных транскриптов. ЛОР &quot;&gt; Для восстановления динамики производства в мРНК время наблюдаемые данные снимка должно быть по сравнению с тем, что ожидается от модели базового поведения. Существуют теоретические ограничения, когда такие&quot; снимки &quot;данных экспрессии генов может быть использован для определения основной динамики экспрессии генов и какие виды моделей можно выделить 21. для метаболического цикла данных, а не непосредственно показывающие наличие временных колебаний, статистические измерения были осуществлены обосновать, что на самом деле существует автономная ячейка колебательные программы в соответствии с объемной микрочипов измерений.

Использование объемных методов измерения, это не возможно для анализа количества транскриптов или транскрипционную активность в отдельные клетки 1. Использование флуоресцирующих белков обусловлен промоторов интерес в качестве репортеров экспрессии гена может решить эту проблему в некоторой степени, но время, необходимое для флуоресцентного белка сложить скрывает рано динамики. Долгосрочные флуоресцентные белки также не может сообщить мРНК жизней. FISH метод может быть использован для анализа мРНК во время его жизненного цикла, от инициации транскрипции в ядре последующим созреванием и распада в отдельные клетки, с одной молекулы разрешение. Оригинальный экспериментов на месте для визуализации нуклеиновых кислот использовали радиоактивно РНК-зонды для исследования ДНК элементов. К их числу относятся визуализация рибосомальной ДНК в яичниках лягушки Xenopus Laevis 2 и сателлитной ДНК в ткани мыши 3. Первый флуоресцентный на месте экспериментаiment использовали молекулу РНК отмечены флуорофором чтобы исследовать определенные последовательности ДНК 4. Первым применением флуоресцентных зондов для визуализации РНК на месте была визуализация экспрессии гена актина в мышечных тканях куриных культуры 5. Совсем недавно, в начинающие дрожжи, рыба использовалась для изучения колебаний в транскрипции во время цикла дрожжей метаболических 6, распад мРНК во время клеточного цикла 7 и пространственной локализации транскриптов мРНК во время митоза 8. Рыба была использована в дрожжах, чтобы показать, что некоррелированного колебания конститутивной транскрипции генов, которые составляют более половины всех генов дрожжей, возникают из некоррелированного инициации транскрипции 9. В не-дрожжевых видов, FISH была использована для определения стволовых клеток маркеров в кишечнике мыши 10 и определить, что неполные проницаемость клеточной судьбы могут возникнуть в результате стохастического экспрессии генов колебания C.Элеганс эмбрионов 11. FISH метод, описанный здесь работает путем гибридизации меченного красителем, одноцепочечной ДНК-зондов мРНК сообщений. Клетки отображаемого мРНК и подсчитывают с помощью точечного обнаружения алгоритма. Одноцепочечных зонды могут быть созданы с помощью синтезатора ДНК и затем метили (называемый здесь Певица зонды) или заказать коммерчески как предварительно меченых зондов (Stellaris зонды) 12,13. Одно из основных различий между певцом и Stellaris зондов, что певец зонды больше (~ 50 б.п.) и мульти-меченных в то время как Stellaris зонды короткие (~ 20 б.п.) только одна метка на зонд, как описано Радж и др. 14. Кроме того, Stellaris подход использует гораздо больше зондов на ген, чем у Singer (~ 30 против 5 зондов на ген, соответственно). Ниже мы приводим протокол, который описывает использование любого типа зонда. В разделе 2, мы предоставляем протокол для маркировки амино-аллил тимидином содержащих зонды Wго выбрали Cy красителя. Обзор вычислительных шагов, необходимых для идентификации одного пятна мРНК приведена в разделе 7.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanadyl Ribonucleoside Complex</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1402S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyticase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5263</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1010954001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (RNase free)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03446l</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI, dilactate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9564</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X (RNase free)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9624</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Shelton Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6001</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline-sodium citrate (SSC) 20X</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82021-484</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide (deionized)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9342</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158968</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0543</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3155</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>150710</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylysine (0.01%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>Cs-18R15</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28304</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FISH Probes</td>
			<td>Biosearch Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Custom order for your desired mRNA sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 96-well plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>265300</td>
			<td>Alternative to coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351143</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3, Cy3.5, Cy5 dyes</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>monofunctional NHS-ester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma-Preen I Cleaner</td>
			<td>Terra Universal</td>
			<td>9505-00</td>
			<td>Controller (Cat #9505-17 optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Alcatel</td>
			<td>205SDMLAM</td>
			<td>For operating Plasma-Preen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-UB617R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>X-Cite</td>
			<td>XCT 10-A</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Sets</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR,U-NSP104V2-SPR.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled CCD or EMCCD Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C4742-98-24ER</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and analysis of mrna molecules using fluorescence in situ hybridization in saccharomyces cerevisiae

Флуоресценции в гибридизация (FISH) метод позволяет обнаружить нуклеиновых кислот в клеточной среде родного. Здесь мы предлагаем протокол для использования FISH для количественного определения количества мРНК в отдельные клетки дрожжей. Клетки могут быть выращены в любом состоянии интерес, а затем фиксировали и сделаны проницаемыми. Впоследствии несколько одноцепочечной deoxyoligonucleotides конъюгированные с флуоресцентными красителями используются для маркировки и визуализировать мРНК. Ограниченное дифракцией флуоресценции от одиночных молекул мРНК количественно с использованием точечного алгоритма обнаружения для определения и подсчета количества мРНК в клетке. В то время как более стандартные методы количественной оценки северной пятна, RT-PCR и микрочипов экспрессии генов предоставлять информацию о среднем мРНК в объеме населения, FISH облегчает как подсчет и локализации этих мРНК в отдельные клетки при одной молекулы разрешение.

3 показана типичная гистограмма вычисляется из FISH изображения и используется для определения количества мРНК присутствует в отдельные клетки. Важным преимуществом микроскопии на основе количественного РНК является то, что можно получить информацию о локализации транскриптов. Например, мы использовали FISH для выявления мРНК в одиночных камерах индуцибельного CBF1 аллели (рис. 4). Поскольку многие молекулы мРНК, которые присутствуют на месте транскрипции, мы можем определить наличие и расположение сайтов транскрипции в ядре. За счет использования различных красителей для маркировки мРНК различных генов, можно количественно нескольких видов мРНК в тех же клетках. Чтобы продемонстрировать это, дрожжевые клетки инкубировали в присутствии α-фактора и сорбит. FUS1 транскрипции (Quasar670 краситель, красный) индуцируется α-фактора. STL1 транскрипции (Квазар 570 красителя, зеленый) индуцируется повышение внеклеточных осмолярности ( <stronG&gt; Рисунок 5). Рисунок 4 является примером FISH с певицей зондов. Рисунок 5 является примером рыбы с Stellaris зондов. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig1.jpg" /> Рисунок 1. Схема экспериментальной процедуры FISH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50382/50382fig1large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок</a> . <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig2.jpg" /> Рисунок 2. Схематическое изображение трубопровода анализа. Конечный пятна определяются в крайнем правом рисунке. <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig3.jpg" /> Рисунок 3. Гистограмма интенсивности месте для конкретного гена с использованием Певица зондов </strong&gt;. Датчик интенсивности вычисляются как внутри, (красный) и внешним (синий) клеток. Низкая интенсивность пятна либо шумов или одинарных зондов. Настоящее сообщения мРНК помечены с несколькими зондами. При использовании Stellaris зондов, один зонды менее обнаруживаемые и, следовательно, пороги и фильтрации должны быть соответствующим образом скорректированы. <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig4.jpg" /> Рисунок 4. Представитель результаты Певица процедуры FISH. В этом эксперименте CBF1 транскрипции активируется с индуцируемым промотором 18. Ядра окрашиваются в синий с DAPI. CBF1 мРНК помечены Cy3-меченых зондов. Белые стрелки обозначения присутствия CBF1 сайтов транскрипции в ядре. Одноместный транскриптов мРНК видны в цитоплазме. <img alt="Рисунок 5" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig5.jpg" /> Рисунок 5. Представитель результаты Стелларис процедуры FISH. Клетки дрожжей МАТа одновременно воздействию 30 нг / мл α-фактора и 0,75 М сорбитол в течение 10 мин и одновременно исследовали на FUS1 (Квазар 670, красный) и STL1 (Квазар 570, зеленый) транскриптов. В выделенном окне, мы можем видеть одну ячейку реагируя только на феромоны (FUS1 стартовый сайт, красный), а другой преимущественно в ответ на сорбит (STL1 сайт начала, зеленый).

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Этот протокол описывает экспериментальную процедуру выполнения флуоресценции<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация (FISH) для подсчета мРНК в одиночных камерах в одной молекулы разрешение.

Визуализации и анализа молекул мРНК с помощью флуоресцентной<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

visualization-analysis-mrna-molecules-using-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

34.6K Views.  Princeton University. Этот протокол описывает экспериментальную процедуру выполнения флуоресценции На месте Гибридизация (FISH) для подсчета мРНК в одиночных камерах в одной молекулы разрешение.

Video: Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Препарирование Saccharomyces CEREVISIAE Сумки

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Флуоресценция На месте Гибридизации (FISH) протокола в человеческой сперме

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Количественные Phosphoproteomics в жирные кислоты Вынужденное Saccharomyces CEREVISIAE</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray анализа для Saccharomyces CEREVISIAE</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Флуоресценция Пробирной микроскопии для мониторинга Mitophagy в Дрожжи Saccharomyces CEREVISIAE

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Обнаружение вирусной РНК с помощью флуоресцентного<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

В сочетании Анализы для мониторинга рефолдинг Белок в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Измерение мРНК темпы разложения в<em&gt; Saccharomyces Cerevisiae</em&gt; Использование<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Штаммы

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Простой метод ДНК флуоресценции<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация, чтобы раздавил хромосом

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.