Research in the author&#8217;s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board&#8217;s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.

1. Рост клеток дрожжей <ol><li> Выберите соответствующие штаммы дрожжей, которые будут использоваться для измерения скорость распада мРНК. Для подавления транскрипции с помощью чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II, использовать дрожжевые штаммы, несущие rpb1-1 мутацию 1. Получить этот штамм дрожжей из лаборатории, который уже имеет один или генерировать его в лаборатории с помощью стандартных методов, если конкретный генетический фон требуется 9. </li><li> Использование метода стерилизации, подготовки дрожжей СМИ, используя стандартные процедуры 10. Если выбор не требуется, подготовить мультимедийные такие как YPD. С другой стороны, подготовка селективной среде, если дрожжевые клетки, трансформированные плазмидами, и выбор не требуется. Автоклав СМИ. </li><li> Выращивают дрожжевых клеток при 28 ° С, которая является разрешающей температуре для этого штамма дрожжей. Сделайте это в два этапа: <ol><li> Для первого O / N, растут дрожжевых клеток в 5 мл питательной среды на насыщение.</li><li> Настройка второго O / N в конце второго дня. Для второго O / N, инокуляции различные количества дрожжевых клеток от первого O / N в от 100 до 150 мл питательной среды (в пределах от 100 мкл до 1 мл, 2 мл или более, в зависимости от того, когда дрожжевые клетки должны быть собирают на следующий день). Этот шаг, чтобы гарантировать, что один из культур при правильном OD 600 на следующий день. </li></ol></li></ol> 2. Урожай дрожжевых клеток <ol><li> Приготовьтесь к тому, урожай дрожжевых клеток. Время для этого шага является критическим; маркировать все необходимые трубы и собрать все необходимое оборудование и материалы в одном месте. Предварительный нагрев на водяной бане до 39 ° С и предварительного нагрева два 15 мл пробирках с питательной среды при 28 ° С и при 60 ° С. Примечание: объем 15 мл питательной среды может изменяться в зависимости от количества временных точках клетки должны быть собраны. </li><li> Урожай дрожжевых клеток, когда они достигают ОР 600 от 0,4 до 0,7. Transfэ клетки до 4 - 6 стерильных 50 мл с винтовой крышкой бутылки. Центрифуга при 7500 х г в высокоскоростной центрифуге в течение 5 мин при комнатной температуре. </li><li> Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют гранул в питательной среде 15 мл, что было в равновесие при 28 ° С. Бассейн дрожжевых клеток в одном стерильную колбу объемом 250 мл и уравновешивают их в течение ~ 5 мин при температуре роста 28 ° C. </li><li> После того, как дрожжевые клетки уравновешивали при температуре роста, сразу же добавить 15 мл питательной среды, уравновешенную при 60 ° С, чтобы повысить температуру до 39 ° C (температура) запрещающих и сразу же колбу помещают на водяную баню на 39 ° , Убедитесь, что питательная среда остается в ванне C воды 39 ° в течение оставшихся шагов сбора клеток для того, чтобы транскрипция выключен. </li><li> Урожай клетки в разное время после помещения колбы в водяной бане 39 °. Для первой точки времени, сбора клеток сразу же после помещения колбы в 39 и #176; С. Урожай 3 мл аликвоты и распространять 3 мл на две части, 1,5 мл микроцентрифужных пробирок. Осаждения клеток в течение 10 сек в мини центрифуги или picofuge с быстрым замедлением и вылейте супернатанта. </li><li> Сразу заморозить осадок в сухой лед / этанол бане или в жидком азоте. Назначают первый момент времени клетки собирали в качестве нулевой момент времени. </li><li> Экспериментально определить временные точки клетки собирают в дальнейшем с помощью пилотного эксперимента, в зависимости от мРНК, представляющих интерес. Как правило, урожай дрожжевые клетки в следующих временных точках: 0, 3, 6, 9, 12, 18, ​​25 и 35 мин (рис 2b). Если мРНК полураспада не может быть определена с помощью вышеуказанных точек времени, регулировать эти временные точки. Например, для мРНК с ожидаемым коротким периодом полураспада, использовать более короткие времена точек (то есть, 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 и 18 мин) и мРНК с ожидаемым длинным периодом полураспада, расширить моменты времени. </li><li> После клеток гаrvested, храните их в -80 ° C морозильнике до экстракции РНК осуществляется. </li></ol> 3. Выписка РНК из дрожжевых клеток <ol><li> Для извлечения части РНК протокола, используйте РНКазы методы для предотвращения деградации РНК РНКазы. Подготовка РНКазы решения, посуда и пластиковая посуда для использования в экстракции РНК. </li><li> Извлечение РНК из дрожжевых клеток в соответствии со стандартными протоколами. Как правило, используется метод горячего фенола 12. В качестве альтернативы, использовать наборы, которые могут быть использованы для извлечения РНК из клеток дрожжей. </li><li> Определить количество и чистоту РНК, как правило, путем измерения оптической плотности при 260 и 280 из 2 мкл РНК с помощью NanoDrop. Определить концентрацию РНК от A 260. На основе концентрации, разбавить РНК до 1 мкг / мкл с использованием DEPC обрабатывают водой. ПРИМЕЧАНИЕ: отношение A 260/280 предоставляет информацию о тон чистота РНК. Образец РНК чистым, если соотношение 260/280 2.0 ± 0.1. </li></ol> 4. Северная блот анализ ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте северные помарки количественно уровни мРНК и получить информацию о размере транскриптов. Кроме того, использование нозерн-блоттинга для обнаружения мРНК получения нескольких изоформ одного и того же мРНК. <ol><li> Приготовьте 1,0% агарозном геле с формальдегидом. Запуск равные количества РНК образца на агарозном геле формальдегида с помощью электрофореза в соответствии со стандартными протоколами 12. Запуск РНК лестнице рядом образцов РНК и использовать его для определения размеров РНК, которые обнаружены на севере пятно. Перед передачей РНК, разделенных на агарозном геле формальдегида к мембране, разрезать полосу с РНК лестницы из геля и визуализации с использованием бромистый этидий. Примечание: В качестве альтернативы, если весь гель может быть окрашивали бромистым этидием перед передачей РНК. </li><li>Образцы осле РНК мигрировали в надлежащем расстоянии от геля, трансфер РНК на мембрану с помощью РНКазы методы. Используйте один из нескольких имеющихся протоколов для передачи РНК мембран 12-13. Для передачи РНК на мембрану, сократить мембраны примерно того же размера, что и гель. Передача РНК в соответствии со стандартными протоколами 12. </li><li> УФ кросс-Link РНК с мембраной с помощью УФ-сшивающий агент, следуя инструкциям изготовителя. Кроме того, печь мембраны в печь, установленную на 80 ° C в течение 1 часа. Хранить мембрану при -20 ° С в пластиковом пакете бесконечности, пока он не образует гибрид с специфических зондов. ПРИМЕЧАНИЕ: сухая мембрана также может храниться при комнатной температуре между фильтровальной бумаги. </li></ol> 5. гибридизующиеся Зонды В дополнение к РНК интересов с мембраной Примечание: Один из способов выявления мРНК на мембраны для гибридизации 32 P меченых ДНК-зондов. ВНИМАНИЕ: исследовrchers, работающие с 32 P необходимо использовать защитные процедуры для предотвращения загрязнения. Следуйте институциональные рекомендации по использованию радиоактивных материалов. <ol><li> Подготовка ДНК-зонда путем маркировки 25 - 50 нг ДНК, подлежащей гибридизации с мембраной в соответствии со стандартными протоколами 12. Генерирование фрагмент ДНК с помощью ПЦР или плазмиды пищеварения. Определить удельную активность ДНК-зонда путем подсчета 1 мкл меченого ДНК-зонда после некорпоративные нуклеотиды удал 12. </li><li> Разогреть буфер предгибридизацию / гибридизация при 42 ° C. Использование ~ 10 мл буфера предгибридизацию / гибридизации на 100 см 2 мембраны 12. </li><li> Гибридизоваться 1 - 5 × 10 6 СРМ радиоактивно меченного зонда ДНК на мл буфера гибридизации с мембраной O / N в гибридизации печи для обнаружения мРНК интерес 12. Убедитесь, что во время гибридизации вращение гибридизации печь в направлении,вызывает весь мембраны подвергаться растворе для гибридизации, чтобы обеспечить надлежащее гибридизации. </li><li> Промыть мембраны в два раза при комнатной температуре в течение 15 мин с 50 мл 2 раза ПСПЭ и один раз при 65 ° С с 50 мл 2х ГНПП / 2% SDS в течение 15 мин 12. Оберните мембраны в полиэтиленовую пленку, чтобы убедиться, что он не высохнет и не загрязнять, люминесцентный экран. </li><li> Используя счетчик Гейгера, оценить интенсивность радиоактивности на мембране. Примечание: Эта оценка гарантирует, что мембрана подвергается люминесцентным экраном для соответствующего периода времени. Используйте более длительного времени воздействия для мембран с низким содержанием радиоактивности. </li><li> Для северных пятна, используйте контроль загрузки, чтобы подтвердить, что равные количества РНК установлен на каждом месте. Чтобы сделать это, лишить мембрану и reprobe его с РНК, которая не влияет на процесс изучается. Полоса мембрану, поместив его в стеклянную лоток, содержащий 200 мл кипящей зачистки раствора (0,1% SDS / 0,01 XSСК) в течение 2 мин. Вылейте зачистки решение и повторите процедуру пять раз 12. Примечание:. Пример РНК использовали в качестве контроля нагрузки является SCR1 SCR1 является РНК-полимераза III транскрипт, что является стабильным и в изобилии SCR1 РНК изобилие не должно существенно меняться в течение коротких периодов РНК-полимеразы II, ингибирование.. </li></ol> 6. Количественная РНК, которая связывается с мембраной Примечание: Для определения количества радиоактивности на мембране, подвергнуть мембрану к люминесцентным экраном. После соответствующей времени экспозиции, сканирование, люминесцентный экран, используя Phosphorimager. <ol><li> Сканирование, люминесцентный экран, используя инструкции, предоставленные производителем Phosphorimager. </li><li> Количественная мРНК в каждый момент времени. Количественного определения уровней мРНК с использованием ImageQuant программное обеспечение или программное обеспечение. Нормализация мРНК в каждый момент времени на контроль нагрузки. Если SCR1 был использован в качестве загрузкиконтроль, нормализовать Half-Life северян к SCR1. </li><li> Период полураспада мРНК рассчитывается путем деления количества мРНК оставшееся в каждый момент времени на величину мРНК настоящее в момент времени 0 (начальная точка времени). Графе процентов мРНК оставшееся от времени в полулогарифмическом участка (рис 2С). Рассчитать мРНК полураспада по следующему уравнению: т 1/2 = -0,693 / к (отрицательный 0.693) </li><li> К наклон наиболее соответствующей линии и т 1/2 мРНК Half-Life. </li></ol>

<ol>
	<li>Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+RNA+polymerase+conditional+mutant+that+rapidly+ceases+mRNA+synthesis.">Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis.</a> Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).</li><li>Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+mRNA+stability+and+length+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).</li><li>Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+action+of+thiolutin,+an+inhibitor+of+macromolecular+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 .</li><li>Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Comparison+of+stable+and+unstable+mRNAs+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 .</li><li>Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+Analysis+of+mRNA+Stability+Using+Transcription+Inhibitors+and+Microarrays+Reveals+Postranscriptional+Control+of+Ribosome+Biogenesis+Factors.">Genome-wide Analysis of mRNA Stability Using Transcription Inhibitors and Microarrays Reveals Postranscriptional Control of Ribosome Biogenesis Factors.</a> Mol Cell Biol. 24 (12), 5534-5547 (2004).</li><li>Tani, H., Akimitsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+technology+for+determining+RNA+stability+in+mammalian+cells.">Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells.</a> RNA Biology. 9 (10), 1233-1238 (2012).</li><li>Pelechano, V., Perez-Ortin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+inhibitor+thiolutin+blocks+mRNA+degradation+in+yeast.">The transcriptional inhibitor thiolutin blocks mRNA degradation in yeast.</a> Yeast. 25, 85-92 (2008).</li><li>Kervestin, S., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMD:+a+multifaceted+response+to+premature+translational+termination.">NMD: a multifaceted response to premature translational termination.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 700-712 (2012).</li><li>Kolodziej, P. A., Woychik, N., Liao, S. M., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Polymerase+II+subunit+composition,+stoichiometry+and+phosphorylation.">RNA Polymerase II subunit composition, stoichiometry and phosphorylation.</a> Mol Cell Biol. 10 (5), 1270-1275 (1990).</li><li>Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (1998).</li><li>Kebaara, B. W., Nazarenus, T., Taylor, R., Atkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+affects+relative+nonsense+mRNA+accumulation+in+wild-type+and+upf+mutant+yeast+strains+Current+Genetics).">Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics).</a> 43, 171-177 (2003).</li><li>Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Nonsense-Mediated+mRNA+Decay+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae.</a> Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).</li><li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+measuring+mRNA+Decay+Rate+in+Saccharomycescerevisiae.">Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

Ингибирование синтеза мРНК и мониторинга оборот мРНК в отсутствии нового синтеза является метод, который часто используется для измерения скорости распада мРНК. В S. CEREVISIAE, измерение скоростей мРНК распада путем ингибирования транскрипции с использованием чувствительный к темпе...

Транскрипции и распад мРНК специфическими являются важными детерминантами генной экспрессии. Скорость синтеза и распада специфических мРНК определяет стационарный уровень этой конкретной мРНК. Стационарное состояние уровни мРНК регулируют изобилие мРНК и определить, сколько каждого мРНК доступна для синтеза белка. Измерения мРНК полураспада широко используются для определения скорости распада мРНК. Удельный распада мРНК с различной скоростью, которые связаны с особенностями мРНК, в зависимости от белка, кодируемого мРНК и от условий окружающей среды. В зависимости от техники, используемой для определения скорости распада мРНК, измерения скорость распада может быть определена глобально или для отдельных транскриптов. В дрожжах S. Cerevisiae, методы, которые наиболее часто используются для измерения скорости распада глобальной мРНК включать в себя использование штамм дрожжей, несущих чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II и химической Закавкriptional ингибиторы, такие как thiolutin и 1,10-фенантролина 1-5. Эти методы также могут быть использованы для измерения скорости распада мРНК отдельные 4. Другие способы также могут быть использованы для измерения скорости распада мРНК. Эти методы включают в себя подход к стационарного маркировки или использования молекул мРНК, которые выражаются с регулируемой промотором, который выражается только в некоторых условиях. Каждый из этих методов имеет свои преимущества и недостатки. Методика описана здесь использует чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II. Этот метод использует S. CEREVISIAE в качестве модели, но может были изменены и использованы в других системах с использованием специфических методик транскрипции ингибирования 6. мРНК измерения периода полураспада, использующие чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II широко используются для обоих генома и физических измерений мРНК распада 4-5. Этот метод требует использование specifIC штамм дрожжей, которые таит в себе чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II, rpb1-1 1. Основанием для этого метода является то, что воздействие на чувствительный к температуре штамма дрожжей к непермиссивной температуры ингибирует синтез мРНК. Впоследствии, распад мРНК существовавшие ранее контролируется в различные моменты времени после транскрипции был запрещено. Исчезновение существовавшие ранее мРНК контролируется путем экстракции РНК из дрожжевых клеток в различные моменты времени после транскрипции был выключен. Моменты времени, в котором дрожжевые клетки собирают предопределены пилотного эксперимента, и зависят от стенограммы и системы ведется расследование. Быстрее моменты времени используются для короткоживущих транскриптов, в то время как более длинные временные точки используются для более долгоживущими транскриптов. После распада мРНК контролируется либо северной блот анализа, количественной ПЦР или RNAseq. Измерение мРНК полураспада, используя TEmperature чувствительны аллель РНК-полимеразы II имеет свои преимущества. Во-первых, эта техника легко и прямо вперед. Во-вторых, после того, как штамм дрожжей приобретается или генерируется в лаборатории измерения периода полураспада мРНК может быть определена в различных условиях роста; позволяет определить влияния окружающей среды на мРНК распада. В-третьих, скорость распада мРНК может контролироваться генома. Использование других методов ингибирования транскрипции также имеет свои преимущества и недостатки. Например, использование индуцируемого промотора требуется субклонирования, чтобы генерировать мРНК, которое под контролем регулируемого промотора. Thiolutin не легко доступны и дорого если таковые имеются. Кроме того, режим thiolutin по действию не полностью понимали, и было сообщено, чтобы влиять на другие клеточные процессы, включая ингибирования мРНК распада 7. В качестве альтернативы, 1,10-фенантролина, более легко доступны. Кроме того, все методы, используемые для ингибирования транскрипции может ПертУРБ клеточную функцию и может влиять на различные мРНК в различных направлениях. Следователь должен определить наиболее подходящий метод для использования в своих экспериментальных условиях для достижения наиболее надежные результаты. Чтобы определить, какой метод является наиболее подходящим для их применения, исследователь должен определить стенограммы и функции белков, кодируемых транскриптов ведется расследование. Наиболее надежные измерения скорости мРНК распада являются те, которые определяются с помощью нескольких методов и показать такую ​​же скорость распада. Ни один метод не всегда лучше, и наиболее подходящий метод зависит от конкретной ситуации. Многочисленные исследования, проведенные в S. Cerevisiae измерили скорость распада мРНК в различных условиях и генетического происхождения. Условия что ставки мРНК распада, измеряемые в зависимости от конкретных эксперимент ведется расследование. Измерение скорости распада мРНК в различных клеточных средах определяет, являются ли условия бытияобследованных преимущественно влияют на скорость распада конкретных мРНК. Скорости распада мРНК может также варьировать в зависимости от штамма дрожжей используется. Например, скорость распада мРНК может быть определена в дрожжевых клетках дикого типа и клеток дрожжей с нефункциональной бред-опосредованной деградации мРНК (NMD) пути. Эта мРНК путь деградации встречается во всех эукариотических организмов, которые были изучены до сих пор и это вызывает деградацию мРНК, которые досрочно прекратить перевод 8. ПРО изначально определен как путь, который ухудшает мРНК с преждевременным кодонов терминации или бессмысленных кодонов, но в настоящее время признается в качестве пути, который также регулирует экспрессию не-глупости, содержащих природные мРНК. мРНК, которые стали целями пути быстро деградируют в дрожжевых клетках с функциональным ПРО пути и стабилизируется в дрожжевых клетках с нефункциональном ПРО пути. Таким образом, период полураспада мРНК, которые являются прямыми целями этого пути короче в дикого типа дрожжей челLs по сравнению с дрожжевых клеток с нефункциональной ПРО пути.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1077">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:272px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:479px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Speed Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini Centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Genescreen Plus membrane</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>50-905-0169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hybridization Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>95-0030-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphor screen</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9564-78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Typhoon phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29004080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV cross-linker</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>80-6222-31</td>
			<td>Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80&#176; for 1 hour</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:272px;">NorthernMax prehybridization/hybridization buffer&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM8677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation</td>
			<td></td>
			<td>Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mrna decay rates in saccharomyces cerevisiae using rpb1-1 strains

мРНК уровни стационарные варьируются в зависимости от условий окружающей среды. Регулирование устойчивых уровней накопления государство мРНК гарантирует, что нужное количество белка синтезируется для конкретных условий роста клетки. Один из подходов для измерения скорости распада мРНК ингибирования транскрипции и затем мониторинг исчезновение уже присутствующего мРНК. Скорость распада мРНК может быть количественно и точное время полужизни может быть определено с использованием нескольких методов. В S. Cerevisiae, протоколы, которые измеряют мРНК полураспада были разработаны и включают в себя ингибирования транскрипции мРНК с использованием штаммов, которые укрывают чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II, rpb1-1. Другие методы измерения мРНК наполовину жизни включают ингибирующие транскрипцию с транскрипционными ингибиторов, таких как thiolutin или 1,10-фенантролина, или альтернативно, используя мРНК, которые находятся под контролем регулируемого промоторатаких, как галактоза индуцируемого промотора и-офф ТЕТ системы. Здесь мы описываем измерение S. скорость распада CEREVISIAE мРНК с использованием чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II. Этот метод может быть использован для измерения мРНК скорости распада отдельных мРНК или генома.

<html> Способность этого протокола для точного измерения скорости распада мРНК зависит от ингибирования транскрипции, уборки дрожжевых клеток в соответствующих временных точках и использования РНКазы методов при извлечении РНК и нозерн-блоттинга. Исследование в течение двух мРНК управ...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains at JoVE.com

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Устойчивый государственный уровень специфических мРНК определяется скоростью синтеза и распада мРНК. По всему геному темпы деградации мРНК или нормы распада специфических мРНК может быть измерена путем определения мРНК полураспада. Этот протокол фокусируется на измерении скорости распада мРНК в Saccharomyces CEREVISIAE.

Измерение мРНК темпы разложения в<em&gt; Saccharomyces Cerevisiae</em&gt; Использование<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Штаммы

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

measurement-mrna-decay-rates-saccharomyces-cerevisiae-using-rpb1-1

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

12.4K Views.  Baylor University.  Устойчивый государственный уровень специфических мРНК определяется скоростью синтеза и распада мРНК. По всему геному темпы деградации мРНК или нормы распада специфических мРНК может быть измерена путем определения мРНК полураспада. Этот протокол фокусиру...

Video: Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Препарирование Saccharomyces CEREVISIAE Сумки

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Количественные Phosphoproteomics в жирные кислоты Вынужденное Saccharomyces CEREVISIAE</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray анализа для Saccharomyces CEREVISIAE</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Флуоресценция Пробирной микроскопии для мониторинга Mitophagy в Дрожжи Saccharomyces CEREVISIAE

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Визуализации и анализа молекул мРНК с помощью флуоресцентной<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

В сочетании Анализы для мониторинга рефолдинг Белок в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Очистка муковисцидоза трансмембранного регулятора проводимости белка выражается в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

ЭПР Контролируемый окислительно-восстановительного титрования из кофакторами<em&gt; Saccharomyces Cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Быстрая идентификация химических генетических взаимодействий в<em&gt; Saccharomyces Cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Направленный метод Эволюция<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em&gt;: Mutant Создание и скрининг библиотеки

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...