Мы благодарим всех членов Lenne и Бертран лаборатории, в частности Оливье Блан для разработки программного обеспечения и Жереми Capoulade для обсуждения. Мы также благодарим изображений объекта PICsL-IBDM, в частности Клод Моретти и Brice Detailleur за технической поддержкой. Эта работа была поддержана ATIP грантов от CNRS (до П.-ФЗ и VB), Labex ИНФОРМ грант (П.-ФЗ и VB) и гранта от Sanofi-Aventis (в VB). Мы признаем, Франция-Bioimaging инфраструктуры, поддерживаемый Национальным агентством де-ла-Recherche (ANR-10-INSB-04-01, называют «Investissements d&#39;Avenir&quot;).

1. Настройка Light Лист и Путь обнаружения Рисунок 1 дает общую схему оптического установки. <ol><li> Поместите и исправить микроскоп и лазеры на оптическом столе. </li><li> Комбинат лазеры 488 нм, 561 нм и 405 нм с соответствующими дихроичных зеркал. После дихроичных зеркал, лазеры должны быть точно совмещены. Заметим, что выбор лазерных длин волн, дихроичных зеркал и оптических фильтров определяется из спектров поглощения конкретных флуоресцентных меток, используемых в экспериментах. </li><li> Поместите фильтр перестраиваемый акустическую-оптических (AOTF). Используйте тестовый лист, предоставленную поставщиком для регулировки частоты и мощь AOTF. Когда хорошо выровнены, около 90% мощности лазерного излучения передается при максимальной настройке как измерено PowerMeter. Обратите внимание, что некоторые лазеры могут быть полностью контролируется программным обеспечением, которые могли бы сделать AOTF ненужным. </li><li> Место и закрепитетелескоп. Следует отметить, что телескоп, состоящий из двух линз, которые расширяют луч шириной, равной или большей, чем диаметр задней апертуры освещения объектива. Объектив с наименьшим фокусным расстоянием должно стоять на первом. </li><li> Место, выровнять и зафиксировать перископ принося вверх оптический путь ближе к задней апертуре цилиндрической линзы. Обратите внимание, что два зеркала из перископ установлены таким образом, что их длинная ось лежит на наклона зеркала для того, чтобы отразить полностью расширенную луч. </li><li> Поместите цилиндрическую линзу рядом с перископа выхода. Следует отметить, что цилиндрическая линза фокусирует пучок в одном направлении и выходит она коллимированный в другом направлении, тем самым образуя легкую лист. </li><li> Перефокусируйте образованную светло-лист с помощью подсветки линзы объектива. Заметим, что образ фокусом освещения цели должны совпадать с объекта координационного центра объектива обнаружения. Направляйте лучна экране (например, стены) на большом расстоянии. Перемещение подсветки цели вдоль оси пучка света, чтобы получить на экране четкие контуры светового листа. </li><li> Поместите четырехъядерный линия (405/488/561/638) фильтров выбросов в соответствующие места в микроскоп (куб). </li><li> Поместите EMCCD камеру на выходной порт микроскопа. </li><li> Fix первый ручной этап перевода на столик микроскопа с помощью винтов в отверстия, просверленные в столик микроскопа. Следует отметить, что край этапе перевода должен быть расположен приблизительно в 2 см от центра столике микроскопа, так что кювета сосредоточена ниже обнаружения объектива. </li><li> Закрепите второй ручной этап перевода на первой. Направления два этапа должны быть перпендикулярны (X и Y) переводы. </li><li> Закрепите этап Z пьезоэлектрический в верхней части двух предыдущих этапов. Следует отметить, что моторизованный этап может быть использован вместо пьезоэлектрической стадии. </li><li> Закрепите кюветы HoldeR (рис. 2) в верхней части этапов. Кювета, таким образом, быть размещены на пересечении пути освещения и пути обнаружения, которые перпендикулярны друг другу. </li></ol> 2. Проверка Light Лист <ol><li> Заполните стеклянную кювету с флуоресцентным решения, и разместить его на держатель образца на пересечении двух оптических путей. Свет лист, таким образом, видно. Он должен быть горизонтальным, и симметричный / по центру по отношению к обнаружения объектива. </li><li> Извлеките цилиндрическую линзу и получить изображение, чтобы измерить толщину листа света. Следует отметить, что толщина листа света зависит от числовой апертуры (NA) осветительного объектива (примерно 3-4 мкм для NA = 0,3). Обратите внимание, что для данного объектива, толщина светового листа может быть увеличена за счет уменьшения размера пучка, поступающего в заднюю апертуру с разрезом. Обратите внимание, что флуоресцентные микросферы могут быть использованы для измерения топорриала и боковой Разрешение микроскопа. </li><li> Установите на цилиндрическую линзу перед началом эксперимента. </li></ol> 3. Монтаж С. Элеганс Эмбрионы Следующие шаги изображены на рисунке 3. <ol><li> Используйте ручку бриллиантами маркировки отрезать кусок предметного стекла 10 х 20 х 1 мм. </li><li> Подготовьте 5% бактоагар в воде, варить его и поддерживать его в нагревательном блоке при 60 ° С </li><li> Добавить 50 мкл поли-L-лизина на одной стороне разреза части слайда, дают ей высохнуть. </li><li> Поставьте микроскопа на скамейке и исправить ее. </li><li> Juxtapose отрезанный кусок слайда с фиксированной слайда и добавить каплю расплавленного агара на самом верху. Сожмите агар с использованием другой чистый микроскопа, чтобы получить тонкий агар площадку. </li><li> Разрешить агар площадку высохнуть, прежде чем снимать верхнюю слайд. </li><li> Разрежьте агар площадку на стороне фиксированной горкой для того, чтобы оставить избыток примерно 3 мм Øе агар и удалить мягко фиксированную слайд. </li><li> Добавить 50 мкл поли-L-лизина на агар и дайте ему полностью высохнуть. </li><li> Положите беременных червей в среде М9 в часовое стекло. </li><li> Обрежьте червей на уровне вульвы скальпелем, чтобы освободить эмбрионов. </li><li> Под бинокль определить эмбрионов на стадии интерес и собирать их с помощью микрокапиллярных пипетки. </li><li> Поместите эмбрионов со стороны агара, покрытые поли-L-лизина, который выступает из разрезанной части слайда. Наведите эмбрионов в непосредственной близости от границы слайда. Не устанавливайте эмбрионов на границе агара, потому что они не будут достаточно стабильными. Удалить жидкость осторожно так, что эмбрионы будет прилипать на поли-L-лизина слоя. </li><li> Быстро выровнять эмбрионов, чтобы избежать высыхания. </li><li> Поместите сократить слайд в пластиковой чашке Петри и осторожно добавить среде М9, чтобы покрыть слайд. </li><li> Проверьте под бинокль, что яйца все еще застряли на агар. </литий&gt; </ol> 4. Запись C. Разработка Элеганс <ol><li> Fix предыдущую подготовку (выемка горка, агар плюс эмбрионов) в держатель образца и поместить его в кювете. Рисунок 4 описывает самодельный держатель и 5 показан вид на кювету в контексте наблюдения. </li><li> Fix кювету на пьезоэлектрического этапе. </li><li> Определить положение эмбрионов с ярким поля освещения. </li><li> Запустите самодельное программное обеспечение, управляющий AOTF, камеру и пьезоэлектрический этап. Обратите внимание, что бесплатное программное обеспечение, например, микроменеджер, также может быть использован. </li><li> Выберите лазерной линии и мощности (AOTF). </li><li> Отрегулируйте положение светового листа с помощью этап 3 направления поддержки цилиндрическую линзу и освещения объектив. Переместить сцену вдоль поперечного направления (X), чтобы получить самый яркий сигнал. Регулировка затем Z положение светового листа, и продольное положение (Y), чтобы получить тыс.э лучшее отношение сигнала к шуму. Следует отметить, что положение светового листа фокусе возможно, должны быть скорректированы с одного эмбриона к другому, чтобы исправить различия в легких длин путей. </li><li> Для приобретения покадровой изображений выберите время экспозиции, получить, время между двумя изображениями, а также о количестве изображений, которые будут приобретены, и мощности лазера. Для 2 приобретении цвета, выбрать второй лазерный луч. Две цветные изображения приобретаются последовательно. </li><li> Для приобретения аз стек, также выбрать расстояние между двумя ломтиками и начало и конец позиции пьезоэлектрических. </li></ol>

<ol>
	<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136, 1963-1975 (2009).</li><li>Reynaud, E. G., Krzic, U., Greger, K., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet-based+fluorescence+microscopy:+more+dimensions,+more+photons,+and+less+photodamage.">Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage.</a> HFSP J. 2, 266-275 (2008).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 100, 64-119 (1983).</li><li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans.">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods Cell Biol. 106, 377-412 (2011).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+(iSPIM)+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans.">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17708-17713 (2011).</li><li>Giurumescu, C. A., Kang, S., Planchon, T. A., Betzig, E., Bloomekatz, J., Yelon, D., Cosman, P., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+semi-automated+analysis+of+morphogenesis+with+single-cell+resolution+in+complex+embryos.">Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos.</a> Development. 139, 4271-4279 (2012).</li><li>Gao, L., Shao, L., Higgins, C. D., Poulton, J. S., Peifer, M., Davidson, M. W., Wu, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+Imaging+beyond+the+Diffraction+Limit+of+3D+Dynamics+in+Thickly+Fluorescent+Specimens.">Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens.</a> Cell. 151, 1370-1385 (2012).</li><li>Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiview+light-sheet+microscope+for+rapid+in+toto+imaging.">Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging.</a> Nat Methods. 9, 730-733 (2012).</li><li>Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-speed+imaging+of+entire+developing+embryos+with+simultaneous+multiview+light-sheet+microscopy.">Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy.</a> Nat Methods. 9, 755-763 (2012).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even+fluorescence+excitation+by+multidirectional+selective+plane+illumination+microscopy+(mSPIM).">Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM).</a> Opt Lett. 32, 2608-2610 (2007).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Этот протокол описывает простую настройку света листового микроскопии для в естественных изображений C. Элеганс эмбрионов. Оптические элементы, необходимые для создания и выравнивания светового лист, в том числе лазеров, расширителя пучка, коллимации и фокусирующих линз, может быть легко установлен на оптической скамье. В сочетании с прямой микроскоп для пути обнаружения и камерой, это обеспечивает простое решение для установки света лист микроскопа. Эта геометрия делает среду образец просто. Живой образец помещают в стеклянную кювету, которая проводится, расположенным и переехал небольшим набором механических частей. Как лист освещение микроскопия широкий методика поле с возможностью секционирования, только один ось моторизованный движение, необходимое для 3D изображений. Это ограничивает требование синхронизации к одному сканирующего элемента и способствует разработке программного обеспечения. По сравнению с ISPIM 6 прямохождение геометрическимры позволяет использовать высокое NA объектива для обнаружения. По сравнению с SPIM установок с объективов в горизонтальной плоскости монтаж образца и изображений из серии эмбрионов легче. В целом, реализация этой техники прост и может быть достигнуто с небольшим опытом работы в оптике. Это более дешевая альтернатива конфокальной микроскопов с преимуществами более высокой скорости и уменьшения фототоксичности но недостатком более низким разрешением осевой. Мы также разработали простой и воспроизводимый способ монтирования C. эмбрионы Элеганс для естественных изображений с использованием этой системы. Процедура монтажа быстро (15 мин) и подходит для повседневной экспериментов. Для С. томография Элеганс, преимущества этой простой установки как минимум два-складки: (я) в области обработки изображений Тото можно без вращения и, следовательно, 3D-реконструкция проста; (II) образец монтаж легко и множественные эмбрионы могут быть последовательно отображенына том же слайде. Мы показали примеры покадровой фильмов с достаточной временным разрешением для наблюдения деления клеток и изменения формы клеток. Власть света листового микроскопии для изучения C. разработка Элеганс также был недавно показано другими 6, 7, 8. Таким образом, этот метод будет очень полезно для изучения морфогенеза и паттерна С. Элеганс эмбрионов. Может эта система также может быть использован для анализа развития других модельных организмов? Важно признать, что реализация листового освещения микроскопии для малого и прозрачной организма, таких как C. Элеганс является менее строгим, чем для более крупных организмов, таких как эмбрионов дрозофилы. в целом визуализации дрозофилы обычно требуется вращение и с несколькими представлениями реконструкции 9, 10. Возбуждение с двух сторон с коллинеарных объективных возбуждения линз также может снижение теневые эффекты, вызванные ослабляетсяион света 11. Тем не менее, установка, представленные здесь, все еще ​​приспособлены к одной стороне изображение эмбрионов Drosophila, с низкой отбеливания и низкой photoxicity. Эта установка также может быть полезно изображения малого и прозрачных эмбрионах, таких как асцидий или рыбок данио.

Формирование и формирование организма включает в себя клеточные движения, изменения формы клеток, деление клеток и дифференцировку клеток. Понимание прогрессирование и координации этих процессов требуют быстрых инструментов образа с трех измерениях возможностей и субклеточном резолюции. Среди методов с этими в естественных условиях возможности визуализации, свет лист освещение микроскопия также называют одного / селективный самолет освещение микроскопия имеет уникальное преимущество получения низких-фототоксичной эффекты и низким фотообесцвечивания 1,2. В листового освещения микроскопии, образец освещается со стороны световым листа, который выполняет оптического секционирования. Путь освещение и путь обнаружения перпендикулярны друг друга, и свет лист выровнен совпадает с объектной фокальной плоскости объектива обнаружения. Образец помещают на пересечении двух путей,й можно перемещать вдоль оси обнаружения, чтобы 3D визуализации. Только плоскость интерес горит и все точки этой плоскости обнаруживаются в то же время. Это значительно увеличивает скорость сбора и снижает фотообесцвечивания а также фототоксичность по сравнению с конфокальной микроскопии 3. Практически, лист освещение микроскопии проста в настройке и выравнивания: для двумерной визуализации, сканирования не нужно ни для части обнаружения, ни для освещения части; как метод широким полем с возможностью секционирования, трехмерных изображений может быть получено одним движением оси стадии держа образец. Здесь мы представляем создание простого света листового микроскопа и его реализации для в целом визуализации С. Элеганс эмбрионов. С. Элеганс эмбрионов хорошо подходят, чтобы жить в естественных условиях ИмаПеренять из-за их прозрачности, инвариант происхождение и стереотипные ячейку позиционирует 4,5. Разработанный свет установка лист на основе стандартного вертикального микроскопа для обнаружения. Протокол, представленные ниже подробно описывается, как построить и выровнять модуль / путь, испытание возбуждения и характеризуют света лист и установите образец для 3D визуализации. Он также приводит примеры покадровой фильмов, приобретенных с установкой на различных штаммов, выражающих флуоресцентных маркеров.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td>SPIM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Detection</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>upright microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axiophot 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>100xW objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm)&#160;</td>
			<td>NIKON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>EMCCD back illuminated</td>
			<td>ANDOR</td>
			<td>DU-885K-CS0-#VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Illumination</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>LASER 488nm / 60mW</td>
			<td>TOPTICA</td>
			<td>iBeam smart</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>LASER 405nm / 120mW</td>
			<td>TOPTICA</td>
			<td>iBeam smart</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td>LASER 561nm / 500mW</td>
			<td>COBOLT</td>
			<td>JIVE 500</td>
			<td>&#160;for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638</td>
			<td>AHF</td>
			<td>F57-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Dichroic 405</td>
			<td>AHF</td>
			<td>F38-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Dichroic 488</td>
			<td>SEMROCK</td>
			<td>Di01-R488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>AOTF</td>
			<td>AA</td>
			<td>AOTFnC-400.650-TN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>mirror</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>lens 50mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td></td>
			<td>telescope 5X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>lens 200mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td></td>
			<td>telescope 5X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>periscope</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>RS99/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cylindrical lens f=100mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>ACY254-100-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>10X NA 0,3</td>
			<td>NIKON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>xyz stage</td>
			<td>NEWPORT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sample</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Bectkton Dickinson</td>
			<td>214010</td>
			<td>5% in water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Poly-L-Lysine solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L</td>
			<td>Havard Appartus</td>
			<td>30-0019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Aspiration tube (mouth pipette)</td>
			<td>Dutsher</td>
			<td>55005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>M9 medium:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>KH2PO4 (3g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Na2HPO4 (6g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>NaCL (5g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>MgSO4 (1mM final)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cuvette holder</td>
			<td>HOME MADE</td>
			<td></td>
			<td>made by Brice Detailleur&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>sample holder</td>
			<td>HOME MADE</td>
			<td></td>
			<td>made by Claude Moretti&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>x stage</td>
			<td>NEWPORT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>coverslip 50x20x1mm</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td></td>
			<td>cut then in 10x20x1mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>piezo electric stage with amplifier/controller</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-622.ZCD / E-625.CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cuvette 40mmx40mmx10mm</td>
			<td>HELLMA</td>
			<td>704.002-OG.40 mm- 10mm high</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Diamond Point Glass Marking Pencil</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td>C++ (Qt) home made software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>developed by Olivier Blanc and Claire Chard&#232;s, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

setting up a simple light sheet microscope for in toto imaging of c. elegans development

Быстрые и низкие фототоксические методы визуализации являются предпосылкой для изучения развития организмов в целом. Свет лист на основе микроскопии снижает фото-отбеливание и фототоксические эффекты по сравнению с конфокальной микроскопии, обеспечивая при этом 3D изображения с субклеточной резолюции. Здесь мы представляем установку светового листа на основе микроскопа, который состоит из прямой микроскоп и небольшим набором оптико-механических элементов для генерации светового листа. Протокол описывает, как построить, совместите микроскоп и характеризуют света лист. Кроме того, подробно описывается, как реализовать метод для в целом визуализации С. Элеганс эмбрионов с использованием простого наблюдения камеры. Метод позволяет захват 3D две цветов покадровой фильмов по несколько часов развития. Это должно облегчить отслеживание формы клеток, клеточных делений и меченных белков в течение длительных периодов времени.

Три 3D эксперименты покадровой записи с трех разных C. Элеганс штаммы иллюстрируют тип данных, которые можно получить при помощи светового микроскопа лист установку, описанную выше. Мы проверили, что в этих условиях эмбрионы развиваются в нормальном темпе и пережить изображений, в соответствии с более ранними сообщениями о том, что изображения SPIM вызывает только низкие уровни фототоксичности в С. Элеганс эмбрионов 6,7. Первый штамм выражает гистонов, слитый с GFP (zuIs178; stIs10024). Запись проводили в течение 2 часов со стеком 20 ломтиков (расстояние между кусочками 1 мкм) каждые 37 сек. 6 иллюстрирует одну плоскость стека в различные моменты времени. Оба интерфазовыми ядер (стрелка) и сгущенное митотический хроматин (стрелы) четко видны. Второй штамм выражает тубулина, слитый с GFP (ruIs57) и гистоновслит с mCherry (itIs37; stIs10226). Запись проводилась в течение 16 мин со стеком 20 ломтиков (расстояние между слоями 1 мкм), принятым каждый 105 сек. Рисунок 7 иллюстрирует различные самолеты стека и различные моменты времени. Соответствующий фильм 1 отображает 3D реконструкции на 3 последовательных временных точках. Во время деления, митотическое веретено (зеленый) и сокращенная хромосомы (красный) отчетливо видны позволяя отслеживать деление клетки ориентаций в процессе разработки. Третий штамм выражает аполипопротеина ВИТ-2, слитый с GFP (pwIs23) и связанный с мембраной mCherry (ltIs44). Запись проводилась в течение 25 мин со стеком 10 ломтиков (расстояние между слоями 1 мкм), принятым каждые 30 сек. Рисунок 8 иллюстрирует различные самолеты стека и различные моменты времени. Быстрые движения частиц желток липопротеинов (зеленый) в клетках может быть легкопоследовало. <img alt="Рисунок 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig1highres.jpg" width="500" /> Рисунок 1: SPIM оптический установки состоит из освещения и обнаружения единиц, перед и донных видов. В осветительного блока, лазеры, объединенные дихроичных зеркал введите AOTF, которая контролирует власть каждого лазера самостоятельно. Затем телескоп увеличивает размер пучка по 4 раза и перископ доводит ее до высоты микроскопом. Цилиндрическая линза образует световой лист, который переориентирована на подсветки цели. Блок детектирования встроен в вертикального микроскопа и в основном состоит из линзы обнаружения, фильтра, трубки линзы и EMCCD. Образец расположены на пересечении между освещенности и обнаружения путей. Пьезоэлектрический этап позволяет вертикальные (Z) смещения образцадля 3D приобретения. <img alt="Рисунок 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig2highres.jpg" width="500" /> Рисунок 2:. Держатель кюветы держатель состоит из 3 алюминиевых пластин и ввинчивается в пьезоэлектрического стадии. Стеклянная кювета проводится с помощью пружины (в красном). <img alt="Рисунок 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig3highres.jpg" width="500" /> Рисунок 3: Монтаж протокол С. эмбрионы Элеганс для SPIM экспериментов. Вырезать кусок стекла покрывают поли-L-лизина. Колодки агара расположена на поверхности с покрытием. Поли-L-лизин Затем добавляют на агаровой панели. Наконец, С. Elegans эмбрионы были выровнены по поли-L-лизин покрытием агар площадку. Рисунок 4: Держатель образца. Держатель подходит к внутренним размерам стекла кюветы. Два пружины (в красном) провести предметное стекло (описанный на рисунке 3). Этот держатель Затем положить внутрь стеклянной кювете. <img alt="Рисунок 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig5highres.jpg" width="500" /> Рисунок 5:... Держатель образца в контексте наблюдения Эмбрионы иммобилизуют на предметное стекло в соответствии с протоколом подведены на рисунке 3 слайд удерживается держателем образца, описанного на рисунке 4 Держатель образца вставляется в стеклянную кювету, удерживается держателем, описанным на фиг.2. свет лист горизонтально и яlluminates эмбрионов со стороны. Обнаружение объектив расположен вертикально, над образцом. <img alt="Рисунок 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig6highres.jpg" width="500" /> Рисунок 6: Запись из С. Элеганс эмбрионов выражения гистонов :: GFP слияние одной плоскости изображения трансгенного эмбриона выражения гистонов :: GFP фьюжн (zuIs178; stIs10024) в различные моменты времени изображения, извлеченные из 3D-покадровой записи:.. стеки из 20 кусочков ( Расстояние между кусочками 1 мкм); время экспозиции за часть: 30 мс; интервал времени между стеками: 37 сек; Общее время приема: 2 часа. Стрелка: интерфазовыми ядро, стрелы: сгущенное митотический хроматин. При Т = 0 мин эмбрион на стадии 2-клеток и при Т = 120 мин эмбрион содержит около 70 клеток, как ожидалось при нормальных с развитиеммочился (обратите внимание, что только клетки, содержащиеся в одной плоскости могут видеть на фотографиях, и не все клетки эмбриона). Власть освещения было 30 мкВт при 488 нм (измеряется на выходе из освещения цели). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure6.avi" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео.</a> <img alt="Рисунок 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig7highres.jpg" width="500" /> Рисунок 7: Запись из С. Элеганс эмбрионов выражения ТУБУЛИН :: GFP слияния и гистонов :: mCherry фьюжн. изображения, извлеченные из 3D-покадровой записи о С. Элеганс эмбрионов выражения ТУБУЛИН :: GFP слияние (ruIs57) и гистона :: mCherry фьюжн (itIs37; stIs10226). Условия съемки: приобретение стопку 20 ломтиков (расстояние между ломтиками 1мкм) каждый 105 сек; общее время приобретения: 16 мин; Время экспозиции: 200 мс для каждого канала. Панель показывает 10 ломтиков одном стеке. Панель б показывает тот же слайс каждый 210 сек. Власть освещения было 30 мкВт и 300 мкВт, для 488 и 561 нм лазеров, соответственно (измеренных на выходе из освещения цели). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure7.avi" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео.</a> <img alt="Рисунок 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig8highres.jpg" width="500" /> Рисунок 8: Запись из С. Элеганс эмбрионов выражения ВИТ-2 :: GFP слияния и мембрану, ориентированные mCherry. изображения, извлеченные из 3D-покадровой записи о С. Элеганс эмбрионов выражения ВИТ-2 :: GFP слияние (ИЭСs23) и мембрану, ориентированные mCherry (ltIs44). Запись условия: приобретение стопку 10 ломтиков (расстояние между слоями 1 мкм) каждые 30 сек; общее время приобретения: 25 мин; время экспозиции на канал: 200 мс. Панель показывает первые 5 ломтиков одном стеке. Панель б показывает тот же слайс каждый 30сек. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure8.avi" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development at JoVE.com

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Этот протокол описывает установку светового листа микроскопом и его реализацию для в естественных изображений C. Элеганс эмбрионов.

Настройка простого Light Лист микроскоп для<em&gt; В Тото</em&gt; Визуализация<em&gt; С. Элеганс</em&gt; Разработка

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

setting-up-simple-light-sheet-microscope-for-toto-imaging-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

23.1K Views.  UMR7288 CNRS, Aix-Marseille Université.  Этот протокол описывает установку светового листа микроскопом и его реализацию для в естественных изображений C. Элеганс эмбрионов. 

Video: Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Генерация Стабильный Трансгенные Элеганс C. Использование Микроинъекция

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

Основные компоненты светового микроскопа

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Поколение трансгенных С. Элеганс По Biolistic преобразования

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Изображений С. Элеганс Эмбрионы использованием Epifluorescent Микроскоп и открытое программное обеспечение

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi скрининга для выявления Постэмбриональное фенотипы в С. Элеганс</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Метод для культивирования эмбриональных<em&gt; С. Элеганс</em&gt; Клетки

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

Измерения физиологических стрессовых реакций у C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

Измерение токсичности пептида РАН в C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample chamber-based setups, which are specifically designed to preserve the three-dimensional integrity of the specimen and usually feature sample rotation, are the best choice in developmental biology. For instance, they have been used to document the entire embryonic morphogenesis of the fruit fly Drosophila melanogaster and the red flour beetle Tribolium castaneum. However, many available live imaging protocols provide only experimental frameworks for single embryos. Especially for comparative studies, such approaches are inconvenient, since sequentially imaged specimens are affected by ambient variance. Further, this limits the number of specimens that can be assayed within a given time. We provide an experimental framework for simultaneous live imaging that increases the throughput in sample chamber-based setups and thus ensures&#160;similar ambient conditions for all specimens. Firstly, we provide a calibration guideline for light sheet fluorescence microscopes. Secondly, we propose a mounting method for multiple embryos that is compatible with sample rotation. Thirdly, we provide exemplary three-dimensional live imaging datasets of Drosophila, for which we juxtapose three transgenic lines with fluorescently labeled nuclei, as well as of Tribolium, for which we compare the performance of three transgenic sublines that carry the same transgene, but at different genomic locations. Our protocol is specifically designed for comparative studies as it pro-actively addresses ambient variance, which is always present in sequential live imaging. This is especially important for quantitative analyses and characterization of aberrational phenotypes, which result e.g., from knockout experiments. Further, it increases the overall throughput, which is highly convenient when access to light sheet&#160;fluorescence microscopes is limited. Finally, the proposed mounting method can be adapted for other insect species and further model organisms, e.g., zebrafish, with basically no optimization effort.

Light sheet-based fluorescence microscopy is the most valuable tool in developmental biology. A major issue in comparative studies is ambient variance. Our protocol describes an experimental framework for simultaneous live imaging of multiple specimens and, therefore, addresses this issue pro-actively.

Одновременное живое изображение нескольких эмбрионов насекомых в образец камерного листа флуоресценции микроскопов

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid external development, tractable genetics, and translucency of the zebrafish, Danio rerio, LSFM has delivered insights into cardiac form and function at high spatial and temporal resolution without significant phototoxicity or photobleaching. Imaging of beating hearts challenges existing sample preparation and microscopy techniques. One needs to maintain a healthy sample in a constricted field of view and acquire ultrafast images to resolve the heartbeat. Here we describe optimized tools and solutions to study the zebrafish heart in vivo. We demonstrate the applications of bright transgenic lines for labeling the cardiac constituents and present novel gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental defects and changes in heart rate. We also propose a data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging. The entire workflow presented here focuses on zebrafish embryonic heart imaging but can also be applied to various other samples and experiments.

We describe optimized tools to study the zebrafish heart in vivo with light sheet fluorescence microscopy. Specifically, we suggest bright cardiac transgenic lines and present new gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental and heart defects. A possible data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging is also provided.