Этот протокол позволяет эффективно отслеживать клеточные линии и идентичности в живых эмбрионах, одновременно анализируя подробные морфологии клеток, такие как аксоны и дендриты при разработке нейронов C.elegans. По сравнению с конфокалевой микроскопией, перевернутый двухповодный селективный плоскости освещения микроскопии или diSPIM предлагает более высокий сигнал к шуму, более изотропное пространственное разрешение, и лучше подходит для долгосрочной визуализации виво. Начните с добавления 500 микролитров 1%метилцеллюлозы раствора в депрессию вогнутого слайда микроскопа.
Используя платиновый проволочный выбор, перенесите взрослых из средней пластины роста нематод в раствор метилцеллюлозы M9. Используйте заточенные кончики 18 калибровочных подкожных игл, чтобы нарезать каждое животное поперечно в середине тела, по крайней мере от одного до четырех клеточных эмбрионов. С мундштуком аспиратора, мягко удерживаемым между зубами, предварительно заполполньте микрокапильярный пипетку с буфером M9 от 10 до 15 и аккуратно оспирировать несколько эмбрионов со слайда в капилляр.
Раздай эмбрионы в центральный прямоугольник крышки стальной камеры, наполненной свежим буфером M9. Аккуратно ориентируйте эмбрионы вертикально так, чтобы длинная ось каждого эмбриона перпендикулярно длинной оси крышки. Затем поместите стальную камеру изображения в держатель образца на стадии diSPIM.
Чтобы подготовить эмбрионы к визуализации, откройте микро-менеджер и установите лазерную интенсивность до 179 микроватт 0,5% эквивалентности для 488 нанометров и 79 микроватт 0,25% эквивалентности для 561 нанометров. Калибровка между корректировкой программного обеспечения и истинным лазерным выходом должна быть сделана заранее, чтобы установить возможности для конкретных микроватт. В меню плагинов, выберите управление устройством и прикладной научной визуализации diSPIM, чтобы открыть прикладную научную визуализацию двойного вида перевернутой селективной плоскости освещения микроскопии окна.
Под вкладкой приобретения подтвердите, что параметры установлены в соответствии с указанным. Под вкладкой автофокуса установите параметры, как указано. Обратите внимание, что канал автофокуса должен указать ядерный канал флуоресценции для запланированных линейных экспериментов.
Проверьте луч и лист коробки для пути A или B и нажмите жить, чтобы начать изображение приобретения. Откроется окно живого вида. Затем нарисуйте коробку вокруг эмбриона, представляющий интерес, чтобы выбрать область анализа автофокуса эмбриона и нажмите кнопку начала приобретения, чтобы инициировать долгосрочный многомерный захват изображения.
Для просмотра изображений, обработки и анализа линии клеток, после загрузки и извлечения пакета программного обеспечения, дважды нажмите на файл CytoSHOW_app. jnlp, чтобы начать работу CytoSHOW. В меню файлов выберите новый микро-менеджер монитора diSPIM, чтобы найти папку набора корневых данных, в которой были сохранены необработанные изображения микро-менеджера.
Выберите папку в любое время и нажмите кнопку "Открыть". Многомерные навигационные окна будут открыты автоматически как для SPIM A, так и для SPIM B.Using инструмент выбора полигонов, нажмите рядом с передними, задними, спинными и желудочковые края эмбриона интерес для создания шаблона галстук-бабочка над эмбрионом в обоих SPIM И SPIM B просмотров и нажмите diSPIM. Выровнять зеленые и красные каналы для каждой руки SPIM и нажмите diSPIM снова.
Сдвиги будут срабатывать во всех других окнах позиций. Далее нажмите diSPIM и предохранитель, чтобы открыть deconvolved предохранитель diSPIM необработанных объемов данных диалоговое окно и установить параметры, как указано. Когда все параметры будут установлены, нажмите "да" и укажите каталог вывода, в котором можно сохранить обработанные файлы, прежде чем нажать OK. В окне предварительного просмотра переместите планку t-scroll на точку времени два окна и переместите z-ползунок до тех пор, пока вид не будет показан непосредственно вдоль длинной оси эмбриона.
Перемести строку t-scroll обратно в точку времени в окне предварительного просмотра и используйте инструмент выбора линии, чтобы нарисовать линию из вентрального наиболее круглого ядра через плоскость метафазных пластин ячейки AB. Нажмите кнопку предварительного просмотра diSPIM, чтобы сохранить тонкие корректировки ориентации предварительного изображения тома. Установите t-scroll баров окна монитора diSPIM для начала и окончания точки времени полного диапазона изображений для обработки.
Тогда нажмите OK. Для эффективного и точного анализа клеточной линии крайне важно достичь точной ориентации ADL объемов данных до обработки Starry Night. Чтобы открыть серию трассировки линии Starry Night в AceTree, откройте предоставленный индивидуальный файл AceTree и выберите открытый файл настройки, чтобы найти ранее указанный каталог вывода. Откройте предохранитель для эмбриона, представляющий интерес, и выберите отредактированный файл.
Затем нажмите открыть и приступить к визуализации линии и редактирования, как описано ранее. Оптимизированные протоколы не вызывают никакой обнаруживаемой фототоксичности эмбрионов, оцениваемой по времени вылупления и срокам, связанным с вехами развития. Используя этот протокол, как было продемонстрировано, неопознанные клетки в этом трансгенном зеленом флуоресцентном белке, выражаюм штамм нематод, были определены как соответствующие моторным нейронам, клеткам выделительных каналов и двум мышечным клеткам.
Выявленные нейроны были косой формы уже в 360 минут после оплодотворения с более длинной клеточной оси, представляющих последующую ось для нейрита нарастание. С 385 до 410 минут после оплодотворения, РМДД невриты продлен примерно шесть микрометров передней части тела клетки. От 415 до 445 минут после оплодотворения, как невриты продлен dorsally в и вокруг предполагаемого нервного кольца.
В среднем, каждый нейрит RMDD протянулся примерно на 11 микрометров от тела клетки, прежде чем синхронно встречать его контралатеральный аналог на вершине кольца. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что функции развития нейронов для отдельных идентифицируемых клеток могут быть исследованы, сопоставлены и количественно определены с помощью этого интегрированного протокола. Важно помнить, чтобы сориентировать эмбрионы вертикально так, чтобы длинная ось каждого эмбриона перпендикулярно длинной оси крышки.
Используя этот протокол, мы начали исследовать зарождающуюся эмбрионационную нервную систему со всех сторон. Например, при рождении клеток, миграции и дифференциации, формировании нейрита, нарое и фасцикуляции.
