C.elegans эмбриогенез занимает около 13 часов, и, как правило, контролируется путем съемки одного эмбриона за один раз. Наш протокол, однако, позволяет одновременно 3D промежуток времени изображения от 80 до 100 эмбрионов. Возможность сбора данных для большого числа развивающихся эмбрионов C.elegans открывает новый спектр экспериментов, включая количественный анализ событий развития и крупномасштабные экраны.
Этот протокол можно легко адаптировать для захвата различных процессов развития или для изображения эмбрионов, выражаюющих любую комбинацию маркеров в тканях, представляющих интерес. Это сложно правильно разогнать эмбрионы в колодцах. Они должны быть близко друг к другу, чтобы обеспечить захват нескольких эмбрионов на поле без слипания в различных плоскостях.
Мы рекомендуем использовать двух исследователей для бок о бок вскрытия, на льду, и блокирование неиспользованных скважин. Мы также продемонстрируем некоторые полезные приемы для быстрой настройки хорошо постановки 384-хорошо пластины. Начните с уплотнения стеклянного дна 384-хорошо пластины с ПЦР клейкой фольгой, чтобы замаскировать неиспользованные скважины.
Используйте бритву или скальпель, чтобы отрезать фольгу, чтобы разоблачить подмножество скважин для использования. Добавьте 70 микролитров свежеприготовленного TMHC в каждый колодец и держите тарелку на льду. Исключите внешние два ряда пластины, чтобы предотвратить эффект края.
Для быстрого подготовки образца рекомендуется бок о бок вскрытие двумя исследователями. Когда все раствор был покрын, используйте тонкие пинцеты и микроскоп вскрытия для передачи около 10 gravid взрослых в 150 микролитров ледяного раствора TMHC в пределах одного слайда депрессии в состоянии. Используя пинцет и скальпель, вскрыть червей, чтобы освободить эмбрионы и загрузить вытащил капиллярной пипетки в рот аспиратор.
Используйте рот пипетки для передачи всех двух-восьмиклеточной стадии эмбрионов в отдельных скважинах подготовленной пластины и изучить пластину, чтобы подтвердить, что никаких агрегатов нет в любых скважин. Когда все эмбрионы были собраны, урегулировать образцы центрифугации и использовать этанол пропитанной салфетки для удаления любых остатков из нижней части пластины. Поместите пластину в держатель пластины конфокального микроскопа, оснащенного температурой контролируемой среды и использовать 10X цель для выполнения предварительного сканирования каждой хорошо для выявления полей с подходящими эмбрионами.
В конце сканирования переключитесь на цель 60X, отрегулируйте фокусную плоскость в каждой точке, чтобы изображение от одного до четырех полей на колодец и приобретете 18 секций с интервалом в два микрометра каждые 20 минут в течение 10 часов. Когда все изображения были приобретены, выполнить низкий, весь хорошо яркое сканирование, примерно от 20 до 24 часов после начала ночной визуализации для оценки эмбриональной летальности. Для автоматизированной обрезки с использованием embryoCropUI выполняется, сначала скачать программу из Зенодо и testfiles.
zip, чтобы определить, работает ли программа должным образом на платформе. После загрузки, распаковать и перемещаться, чтобы найти embryoCropUI выполняется файл и двойной клик для запуска программы. Выберите открытое для загрузки первого конкретного 4D поля зрения для обрезки.
При обрезке серии TIFF с несколькими измерениями загружается только первое изображение в серии в папке. Когда все изображения были загружены, укажите параметры изображения, выберите фоновое вычитание и коррекцию зрения, а также установите порядок сбора изображений и микрон на пиксель. Затем выберите запуск, новый субфолдер помеченный урожай будет создан в том же пути, как необрезанные папки и обрезанные версии будут сохранены в этом месте.
Для визуализации загрузите открытый и комбинированный плагин MSV2 ImageJ и графические инструкции по пользовательскому интерфейсу Зенодорепов2. docx от Зенодо и открыть плагин в IMageJ. Найдите строки три и четыре и вемите место, в котором будут храниться папки изображений после обрезки.
Имена папок изображений условий, которые должны быть обработаны, и уникальный алфавитный идентификатор для каждого ночного эксперимента. Когда вся информация была введена, нажмите кнопку запуска. Появится окно, которое запустит подсказку для навигации по внешней папке, содержащей обрезанные папки изображений.
После выбора появится другое окно, которое позволит спецификации параметров изображения. Нажмите хорошо. Композитный файл начнет собираться.
Когда композит был создан, просмотрите файлы, которые остаются открытыми. При изображении в сочетании пользовательских репортер штаммов обеспечить информативные считывания для большинства крупных событий развития. Включая спецификацию сульфата, спинную интеркалацию, эпидермальный корпус, удлинение и нейрогенез.
24 часа после инъекции является оптимальной точкой времени для визуализации. На данный момент истощение материнского белка и ингибирование экспрессии зиготического гена являются эффективными, уступая различные, высоко воспроизводимые подписные фенотипы по широкому спектру генов, участвующих в спецификации сульфата и морфогенеза. Важно быть терпеливым во время вскрытия и отбора эмбрионов.
Минимизация слипания и выбор соответствующих координационных плоскостей также имеют важное значение для обеспечения высокого качества данных. Наш протокол может быть выполнен с различными штаммами флуоресцентных маркеров и в сочетании с РНК или мутантами. Наши инструменты обработки позволяют оптимизировать, автоматизировать или провести ручной анализ данных.
Используя штаммы, методы и инструменты, описанные здесь, наша группа выполнила рнк на основе экрана с высоким содержанием, нацеленного примерно на 2000 генов, необходимых для эмбрионального развития. Для этого проекта были необходимы полу-высокие методы пропускной способности.
