Авторы благодарят своих источников финансирования, программу в колледже Уильяма и Мэри Медицинского института Говарда Хьюза Бакалавриат Научное образование; Спонсор Грант: NIH (MSS); Число Грант: R15NS067566. Они также признают, поддержку со стороны колледжа Уильяма и Мэри, биологический факультет и колледж искусств и наук об оказании помощи в уходе за животными.

<ol>
	<li>Eng, M. L., Elliott, J. E., MacDougall-Shackleton, S. A., Letcher, R. J., Williams, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+exposure+to+2,2',4,4',5-pentabromodiphenyl+ether+(BDE-99)+affects+mating+behavior+of+zebra+finches.">Early exposure to 2,2',4,4',5-pentabromodiphenyl ether (BDE-99) affects mating behavior of zebra finches.</a> Toxicol Sci. 127, 269-276 (2012).</li><li>Winter, V., Elliott, J. E., Letcher, R. J., Williams, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+an+egg-injection+method+for+embryotoxicity+studies+in+a+small,+model+songbird,+the+zebra+finch+(Taeniopygia+guttata).">Validation of an egg-injection method for embryotoxicity studies in a small, model songbird, the zebra finch (Taeniopygia guttata).</a> Chemosphere. 90, 125-131 (2013).</li><li>Maney, D. L., Goodson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenomic+mechanisms+of+aggression+in+songbirds.">Neurogenomic mechanisms of aggression in songbirds.</a> Adv Genet. 75, 83-119 (2011).</li><li>Kirn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+of+neurogenesis+and+growth+of+brain+regions+to+song+learning.">The relationship of neurogenesis and growth of brain regions to song learning.</a> Brain and Language. 115, 29-44 (2010).</li><li>Fisher, S. E., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXP2+as+a+molecular+window+into+speech+and+language.">FOXP2 as a molecular window into speech and language.</a> Trends in Genetics. 25, 166-167 (2009).</li><li>Tokarev, K., Tiunova, A., Scharff, C., Anokhin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+for+Song:+Expression+of+C-Fos+and+ZENK+in+the+Zebra+Finch+Song+Nuclei+during+Food+Aversion+Learning.">Food for Song: Expression of C-Fos and ZENK in the Zebra Finch Song Nuclei during Food Aversion Learning.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Vargha-Khadem, F., Gadian, D. G., Copp, A., Mishkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXP2+and+the+neuroanatomy+of+speech+and+language.">FOXP2 and the neuroanatomy of speech and language.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 131-138 (2005).</li><li>Schulz, S. B., Haesler, S., Scharff, C., Rochefort, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+FoxP2+alters+spine+density+in+Area+X+of+the+zebra+finch.">Knockdown of FoxP2 alters spine density in Area X of the zebra finch.</a> Genes, Brain and Behavior. 9, 732-740 (2010).</li><li>Jarvis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+brains+and+a+new+understanding+of+vertebrate+brain+evolution.">Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 151-159 (2005).</li><li>Brainard, M. S., Doupe, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+birdsong:+songbirds+as+a+model+for+basic+applied+medical+research.">Translating birdsong: songbirds as a model for basic applied medical research.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 489-517 (2013).</li><li>Mayer, U., Watanabe, S., Bischof, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+memory+and+the+avian+hippocampus:+Research+in+zebra+finches.">Spatial memory and the avian hippocampus: Research in zebra finches.</a> J Physiol Paris. , (2012).</li><li>Warren, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+a+songbird.">The genome of a songbird.</a> Nature. 464, 757-762 (2010).</li><li>Agate, R. J., Scott, B., Haripal, B., Lois, C., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+songbirds+offer+an+opportunity+to+develop+a+genetic+model+for+vocal+learning.">Transgenic songbirds offer an opportunity to develop a genetic model for vocal learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17963-17967 (2009).</li><li>Birkhead, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+incubation+and+early+hatching+in+brood+parasitic+birds.">Internal incubation and early hatching in brood parasitic birds.</a> Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 278, 1019-1024 (2011).</li><li>Haesler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxP2+expression+in+avian+vocal+learners+and+non-learners.">FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners.</a> J Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).</li><li>Godsave, S. F., Lohmann, R., Vloet, R. P. M., Gahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+receptors+in+the+embryonic+zebra+finch+hindbrain+suggest+a+function+for+maternal+androgens+in+perihatchingsurvival.">Androgen receptors in the embryonic zebra finch hindbrain suggest a function for maternal androgens in perihatchingsurvival.</a> Journal of Comparative Neurology. 453, 57-70 (2002).</li><li>Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick;+a+great+model+system+becomes+even+greater.">The chick; a great model system becomes even greater.</a> Dev Cell. 8, 9-17 (2005).</li><li>Kuenzel, W. J., Medina, L., Csillag, A., Perkel, D. J., Reiner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+avian+subpallium:+new+insights+into+structural+and+functional+subdivisions+occupying+the+lateral+subpallial+wall+and+their+embryological+origins.">The avian subpallium: new insights into structural and functional subdivisions occupying the lateral subpallial wall and their embryological origins.</a> Brain Research. 1424, 67-101 (2011).</li><li>Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+chicken+embryology+to+the+understanding+of+vertebrate+limb+development.">The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development.</a> Mech Dev. 121, 1019-1029 (2004).</li><li>Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rediscovering+the+chick+embryo+as+a+model+to+study+retinal+development.">Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development.</a> Neural Development. 7, (2012).</li><li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development.">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenet Genome Research. 117, 231-239 (2007).</li><li>Murray, J. R., Varian-Ramos, C. W., Welch, Z. S., Saha, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryological+staging+of+the+zebra+finch,+Taeniopygia+guttata.">Embryological staging of the zebra finch, Taeniopygia guttata.</a> J Morphol. , (2013).</li><li>Hawkins, P., Morton, D. B., Cameron, D., Cuthill, I., Francis, R., Freire, R., Gosler, A., Healy, S., Hudson, A., Inglis, I., Jones, A., Kirkwood, J., Lawton, M., Monaghan, P., Sherwin, C., Townsend, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+birds:+refinements+in+husbandry+and+procedures.+Fifth+report+of+BVAAWF/FRAME+/RSPCA/UFAW+Joint+Working+Group+on+Refinement.">Laboratory birds: refinements in husbandry and procedures. Fifth report of BVAAWF/FRAME /RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement.</a> Lab Anim. , (2001).</li><li>Pearse II, R. V., Esshaki, D., Tabin, C. J., Murray, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+expression+analysis+of+intra-+and+extraarticular+connective+tissue.">Genome-wide expression analysis of intra- and extraarticular connective tissue.</a> Journal of Orthopaedic Research. 27, 427-434 (2009).</li><li>Pizard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridization+and+detection+of+RNAs+in+vertebrate+embryos+and+isolated+organs.">Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 66, (2004).</li><li>Warren, M., Puskarczyk, K., Chapman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+proliferation+studies+using+EdUlabeling.">Chick embryo proliferation studies using EdUlabeling.</a> Developmental Dynamics. 238, 944-949 (2009).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+syntesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA syntesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Hoogesteijn, A. L., DeVoogd, T. J., Quimby, F. W., De Caprio, T., Kollias, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+impairment+in+zebra+finches+(Taeinopygia+guttata).">Reproductive impairment in zebra finches (Taeinopygia guttata).</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 24, 219-223 (2005).</li><li>Winter, V., Williams, T. D., Elliott, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-generational+study+of+In+ovo+exposure+to+PBDE-99+in+the+zebra+finch.">A three-generational study of In ovo exposure to PBDE-99 in the zebra finch.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 32, 562-568 (2013).</li><li>Kitulagodage, M., Buttemer, W. A., Astheimer, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adverse+effects+of+fipronil+on+avian+reproduction+and+development:+maternal+transfer+of+fipronil+to+eggs+in+zebra+finch+Taeinopygia+guttata+and+in+ovo+exposure+in+chickens+Gallus+domesticus.">Adverse effects of fipronil on avian reproduction and development: maternal transfer of fipronil to eggs in zebra finch Taeinopygia guttata and in ovo exposure in chickens Gallus domesticus.</a> Ecotoxicology. 20, 653-660 (2011).</li><li>Hallinger, K. K., Zabransky, D. J., Kazmer, K. A., Cristol, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birdsong+differs+between+mercury-polluted+and+reference+sites.">Birdsong differs between mercury-polluted and reference sites.</a> The Auk. 127, 156-161 (2010).</li><li>Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioactive+in+situ+Hybridization+for+Detecting+Diverse+Gene+Expression+Patterns+in+Tissue.">Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li><li>Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+Avian+Brain+Chimeras+Reveal+That+Large+Brain+Size+Differences+Are+Influenced+by+Cell&#8211;Interdependent+Processes.">Interspecies Avian Brain Chimeras Reveal That Large Brain Size Differences Are Influenced by Cell&#8211;Interdependent Processes.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Chen, C. C., Winkler, C. M., Pfenning, A. R., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+the+developing+avian+telencephalon:+Regional+timing+and+brain+subdivision+continuities.">Molecular profiling of the developing avian telencephalon: Regional timing and brain subdivision continuities.</a> The Journal of Comparative Neurology. 521, 3666-3701 (2013).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Последние разработки в эмбрионального руководства промежуточной 22 и генома аннотации сделать Zebra Finch желательно модельный организм для исследований развития. Тем не менее, небольшой размер и хрупкость эмбрионов Zebra Finch, которые варьируются от 3 ​​до 7 мм в несколько этапов 1 - 10 22, может сделать вскрытия трудно 11, 14. Обнаружение и чисто удаления эмбрионов от поверхности желтка может оказаться непростой задачей. Этот протокол обеспечивает достаточно подробную информацию для выполнения процедуры с легкостью. Этот протокол демонстрирует важные шаги, которые не правило, известны, но которые необходимы для обеспечения успешного вскрытия. Например, важно, чтобы оставить небольшой слой желтка между эмбриона и листа вес бумаги, чтобы предотвратить прилипание. Оба также выявление и удаление эмбриона может быть затруднено. Для устранения идентификации эмбрион на поверхности желтка, пролить свет непосредственно над желтка после егобыли удалены из яйца, и посмотреть на желтке под углом 45 °, чтобы найти эмбрион. После того, как эмбрион находится, вырезать желток на вес бумаги заботиться, чтобы не оторвать эмбрион. Если дальнейшие приложения включают изображений для анатомических различий, в гибридизация, или пролиферации клеток анализов, важно, чтобы удалить желточной оболочки на стадии 1 - 8 22 для лучшей визуализации структур. Если возникли трудности при удалении желток или желточной оболочки на ранних стадиях, исправить эмбрион в 4% PFA до мытья его в 1X PBS, чтобы уменьшить эмбриональных хрупкость. По предварительного удаления желточной оболочки во время вскрытия, как описано, структуры четко видны и сохранности в эмбрионах зяблик зебры после выполнения в гибридизация. Ограничение EDU является то, что администрация объемов лекарственных над 478 нл приводит к эмбриональной смертности. Однако подавляющее диапазон доз позволяет varyinУровни г пролиферативной пометки клеток. &quot;Щелчок&quot; реакция используется в этом наборе является меди (I), катализируемой-Алкины-азид-циклоприсоединения (Cu (I) AAC). В данном конкретном реакции, алкин содержащих аналог тимидина молекула (EDU) включен в активно делящихся клеток. Группа алкина в ОБР выступает из спиральной структуры ДНК, и обнаруживается под воздействием молекулы азида, конъюгированного с зеленым флуоресцентным, молекулы, которые связываются с свободного алкина группы. Зеленая флуоресценция показывает недавно пролиферирующих клеток в эмбрионе. Био-ортогональность азида и алкиновые группы предотвращает неспецифическую окрашивание, потому что эти активные формы не естественным образом присутствуют в организме. Кроме того, поскольку ДНК не должны быть денатурированный для того, чтобы протекания реакции, далее ДНК-зависимой анализ может быть легко выполнена 27. Естественное ограничение этого метода является небольшой размер и фрагментСОСТОЯНИЯ эмбрионов зяблик зебры. Удаление желточной оболочки эмбрионов стадии 1 - 15 22 может привести к повреждению эмбриональных структур, если не выполняется с осторожностью. Тем не менее, этот протокол упрощает метод вскрытия, что позволяет исследователям использовать ранние эмбриональные стадии изучить структурные аномалии и экспрессию генов, которые не были ранее изучены в глубину. Этот протокол открывает путь для множества сотовых молекулярной анализов, которые позволят исследователям определить происхождение развития взрослых фенотипов. Например, можно будет изучить экспрессию генов вовлечены в вокальной обучения в различных условиях окружающей среды или после фармакологическое лечение на самых ранних стадиях развития 28 29,30,31. Хотя это и не показано в этой работе, этот метод позволяет потенциально для других процедур, таких как радиоактивные в гибридизация Zebra Finch на срезах тканей и электропорацию / в OVо хирургии 32, 33,34. Учитывая, что Zebra Finch был создан в качестве важного модельного организма в пределах огромного объема литературы, такие исследования дают неиспользованные возможности связать механизмы развития со взрослой физиологии и поведения, в частности, развития языка 7, 9.

Общая цель этой техники является получение Zebra Finch (Taeniopygia Guttata) эмбрионы из самых ранних стадиях эмбриогенеза для использования в широком диапазоне исследований развития. Zebra Finch стали преобладающим певчая птица модель организма и широко используются в различных областях, в том числе токсикологии 1,2, поведение 3, памяти и обучения 4,5,6, сравнительный нейроанатомию 7,8 и развития языка 9,10 . Как единственный певчих птиц с геномом, последовательность, Zebra Finch позволяет молекулярной и генетической изучение порядка Passeriformes, которая представляет более 50% известных видов птиц 11, 12,13. Несмотря на использование взрослых и несовершеннолетних Zebra Finch в разнообразных областях, несколько исследования были проведены на эмбрионах Zebra Finch, особенно на ранних стадиях развития. Это может быть связано с небольшим размером их яиц вй эмбрионы, и их новое положение в качестве модельного организма 14,15,16 для исследований, в которых курица (Gallus Gallus Domesticus) ранее используемых в качестве преобладающей модели системы 17,18,19,20,21. Однако, как не-голосовых учащихся, куры не является подходящим модельной системой для изучения генетической основы вокального обучения, развития вокального обучения, наследственности, поведения, и ганглиев схемы корковой-базальной, участвующих в автомобильных обучения 10. Важно отметить, что эмбрионы Zebra Finch гораздо более тонкий и более легко повредить, чем куриных эмбрионов во время вскрытия и молекулярной процедур. В частности, большая осторожность требуется при выполнении действия пермеабилизации на эмбрионах зяблик зебры. Сильные моющие средства и ферменты, которые не будут вредить куриного эмбриона может привести к повреждению эмбрионов Финч зебры. С точки зрения общего ухода, необходимо поставить Zebra Finch яйца в маленьких чашках перед размещением в инкубаторечтобы предотвратить их от разрушения при прокатке в процессе инкубации. Zebra Finch поддаются поведенческих исследований, легко и плодотворно размножаться круглый год в плену, и вокальные учащиеся. Эти характеристики позволяют использовать Zebra Finch, чтобы удовлетворить потребность в качестве модельного организма, которая интегрирует развитие, генетику, и поведенческие аспекты языка. Методы вскрытия подробно изложено ниже, в сочетании с недавно разработанной промежуточной руководства, характерные для Zebra Finch 22, сделать Zebra Finch более полезными стандартизированная модель развития организм. Однако получение эмбрионов на ранних стадиях может быть сложной. Этот протокол позволяет исследователям легко получить эмбрионов ранних стадий. Исследования следственные скорейшей разработке и молекулярную основу с развитием сложных поведения в Zebra Finch, или токсикологических последствий для развития в других малых, воробьиных птиц найдете эта методология рассечение полезно.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chicken egg incubator</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">We use a Picture Window Hova-Bator Incubator, Circulated Air Model&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10337</td>
			<td>Detection of cell proliferation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use Olympus SZ61</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7&#39;&#39; Drummond capillary for Nanoject II injector</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-00-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drummond Nanoject II microinjector</td>
			<td colspan="2">Drummond</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont Tweezers #55</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td align="right">14099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL Falcon tube (polypropylene)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-443-18&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastPrep Lysis Matrix H tubes</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>6917-100</td>
			<td>Used for RNA extraction, used to homogenize embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber optic illuminator lamps (High Intensity Illuminator)</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries&#160;</td>
			<td colspan="2">Fiber-Lite MI-150&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass vials with screw cap (DEPC treated)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge eppe tube (1.5 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Modeling Clay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Narshige PB-7 needle puller</td>
			<td>Narshige</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Omni Bead Ruptor Homogenizer</td>
			<td style="width:71px;">OMNI International</td>
			<td>19-010</td>
			<td>Used for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="3" height="25" style="height:25px;">4% Paraformaldehyde (4% PFA): 20 mL 8% PFA (32g paraformaldehyde, 350mL sdd H2O, adjust pH to 7.6, 400mL sdd H2O), 20mL 2xPBS</td>
			<td>Fixation of embryos. Caution, is harmful and do not inhale.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="4" height="25" style="height:25px;">Phosphate buffered saline (1xPBS): 200mL 10X PBS, 1800 mL Barnstead H2O, adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="4" height="25" style="height:25px;">Phosphate buffered saline (10xPBS): 800mL Barnstead, 2.013g KCL, 80.063g NaCl, 2.722g KH2PO4 monobasic, 14.196g Na2HPO4 dibasic, 200mL Barnstead H2O, adjust pH to 6.5</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="4" height="25" style="height:25px;">Phosphate buffered saline with 0.1% Tween-20 (1xPTw): 1800mL Barnstead H2O, 200mL 10X PBS, adjust pH to 7.4, 2mL Tween-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35mL Plastic petri dish&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plastic wrap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prepease RNA Spin Kit</td>
			<td>PrepEase, Affymetrix</td>
			<td>78766 1 KT</td>
			<td>Used for RNA extraction, used to homogenize embryos</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Reaction Mix: 875&#956;L 1xPBS, 100mM 20&#956;L CuSO4 (Kit Component E), 5&#956;L Alexa Fluor 488 azide (Kit Component B), 100&#956;L diluted reaction buffer additive (Kit Component F)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10337</td>
			<td>Detection of cell proliferation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">sdd H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seed cup&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use it as a container when incubating eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel scalpel&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard nest box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use Abba Plastic Finch Nestboxes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">4mL, Teflon Lined Cap, Glass Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-912-352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer pipettes (polyethylene)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4x4 weigh paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-898-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and downstream analysis of zebra finch embryos at early stages of development

Zebra Finch (Taeniopygia Guttata) становится все более важным модельным организмом во многих областях исследований, включая токсикологии 1, 2, 3, поведения и памяти и обучения 4,5,6. Как единственный певчих птиц с геномом, последовательность, Zebra Finch имеет большой потенциал для использования в исследованиях развития; Однако на ранних этапах развития Zebra Finch не были хорошо изучены. Отсутствие исследований в развитии Zebra Finch можно отнести к сложности рассекает небольшой яйцо и эмбрион. Следующий метод рассечения минимизирует эмбриональных повреждения тканей, что позволяет для исследования морфологии и экспрессии генов на всех этапах эмбрионального развития. Это позволяет как яркий поле и качество флуоресцентных изображений эмбрионов, использовать в молекулярных процедур, таких как в гибридизация (МОГ), пролиферации клеток анализов и экстракции РНК для количественного анализа, таких как количественного Рил-тайм ПЦР (qtRT-ПЦР). Эта техника позволяет исследователям изучать ранние этапы развития, которые ранее были труднодоступными.

Шаги схематически на рисунке 1 показывают внешний вид эмбриона в то время как прикреплен к желточной оболочки (А) и демонстрируют правильный метод для разделения эмбриона от желтка (B). Эмбрион можно определить по зоне сочленения, который намного легче, чем желточной оболочки. Сам эмбрион часто бывает трудно различить, пока желток не срезан. После того, как эмбрион расчлененный из яйца, он может быть фиксированной или быстро замораживали для дальнейшего использования. Если в гибридизация запланировано на рассеченной эмбриона, необходимо удалить желточной оболочки, которая приклеена к эмбриону через зону перехода. Рисунок 2 иллюстрирует улучшенную видимость эмбриона, как только это мембрану удаляют (С), и правильный способ очистить желточной оболочки (А, В). После вскрытия и фиксации, вся гора в гибридизация проводили, как показано на рисунке 3 (А, А &#39;, В, В&#39;) И фиг.4 (A, A&#39;, B, B &#39;) и фиг.5 (A, B, C) ​​для определения различий в orthodenticle гомеобоксом 2 (Otx2) экспрессии у эмбрионов с развитием подверженных воздействию низких доз метилртути. 5 показан Результаты смысл зонд, демонстрируя отсутствие фоне. На рисунке 4, несмотря на то, расчлененный из яйца в тот же момент времени, эмбрион умственно подвергаются воздействию метилртути (MeHg) продвинулись к стадии 5 22 (В, В &#39;), в то время как контроль эмбрион разработан на сцене 6 22 (А, А »). Группа эмбрионов рассекали и показано на рисунке 4 были собраны из гнезда и взяты из инкубатора в то же время. Хотя некоторые естественные вариации присутствует в развитии, на основе предыдущих данных рассечение, то маловероятно, что колебания температуры в инкубаторе может вызвать только промилле эмбрионы метилртути 2,4 быть развитpmentally задерживается. Различия в стадиях указывают на изменения в клеточной пролиферации в эмбрионах с развитием, подверженных метилртути. Перед вскрытия, EDU вводили в день 2 яйца и инкубировали в течение ночи. После вскрытия и фиксации сцене 16 22 эмбрионов, EDU визуализировали с использованием &quot;нажмите&quot; химию, позволяя обнаруживать размножающихся клеток, как показано на рисунке 6 (А, В, С). Важно внимательно следить за временные точки при размещении яйца в инкубаторе и во время вскрытия, как воздействие метилртути или выполнением анализа EDU может нарушить развитие развития. Самый ранний впрыск проводили на день 0, который был в день сбора, указанный в действии 1.3. Это эмбрион рассекали около 38 часов спустя (этап 7 22). Выживаемость было установлено, что примерно 90% (такой же скоростью, как контрольных эмбрионов) тех пор, пока количество впрыска находилась под 478 нл. 22 эмбрионов, Выделение РНК проводили в соответствии с протоколом производителя, без оптимизации необходимой, как показано на рисунке 7. Удаление желточной оболочки не было необходимости для экстракции РНК и более поздних приложений Qrt-PCR. Примечание: Все цифры эмбрионов ориентированы так, что передние и задние участки расположены в верхней и нижней части изображения, соответственно. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig1highres.jpg" /> Рисунок 1. Порядок размещения и рассекает эмбрионов Zebra Finch, этапы 1-10 22. Найдите эмбрион на покатых желток, пока слабый белый диск не видно (А). Послеэмбрион расположен в центре желтка, желток рассекают ступенчато (B), где первый разрез снимает давление желточной оболочки (1) и последующие сокращений (2) граничат с зоной перехода (Zj), который придерживался желточной оболочки. Масштабные полоски представляют 1 мм. <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig2highres.jpg" /> Рисунок 2. Удаление желточной оболочки и видимости эмбриональных структур. После удаления зародыша от желтка, место эмбриона в чашку Петри, содержащую 4% PFA. Если в гибридизация должна быть выполнена, видимость из эмбриональных структур имеет важное значение и может быть достигнуто путем удаления желточной оболочки (A). Возьмитесь за желточной мембрана с дополнительной тонкой наконечником щипцы и аккуратно очистить его от эмбриона путем обработки эмбрион непосредственно на внешней кромке, в случае необходимости(B). Желточный удаление мембраны увеличивает четкость эмбриональных структур, а также позволяет эмбрионов быть отображены или обработаны в гибридизация (С). Масштабные полоски представляют 1 мм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51596/51596fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig3highres.jpg" /> Рисунок 3. Вся гора в гибридизация осуществляется на эмбрионах зяблик зебры развитием, подверженных метилртути. Паттерны экспрессии orthodenticle гомеобоксом 2 (Otx2) характеризовались в эмбрионах, подверженных 0,0 промилле метилртути (А, А &#39;) и 2,4 промилле метилртути (B, B &#39;) через родителей диеты. Сделайrsal (А) и вентральной (&#39;) выражение Otx2 видна на протяжении среднего мозга и глазных пузырей во время этапа 12 22. Эмбрионы группе лечения были вскрыты в тот же момент времени, но были отстающих в развитии, как показано на спинной (В) и вентральной (В &#39;) вид головных структур, которые характерны для стадии 11 22 Сокращения:. мб, среднего мозга; оп, глазной пузырь. Масштабные полоски представляют 1 мм. <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig4highres.jpg" /> Рисунок 4. Вся гора &#160; на месте &#160; гибридизации выполняется на эмбрионах Zebra Finch развитием, подверженных метилртути. паттерны экспрессии orthodenticle гомеобоксом 2 (Otx2) характеризовались в стадии 6 22 Эмбри<html> ОС подвергается 0,0 промилле метилртути (А, А &#39;) и стадии 5 22 эмбрионов, контактирующие с 2,4 промилле метилртути (В, В&#39;) через родителей диеты. Сокращения: утра, передний край мезодермы; нет, хорда, хорда мезодерма; Ро, proamnion, передняя бластопор; пс, первичная полоска 22. Масштабные полоски представляют 1 мм. <img alt="Рисунок 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig5highres.jpg" width="600" /> Рисунок 5. Всего смонтировать на месте &#160; гибридизации выполняется на эмбрионах зяблик зебры использованием смысл зонд. (А) Стадия 5 22 эмбрионов. (В) Ранняя стадия 6 22 эмбрионов. (С) Стадия 11 22 эмбрионов. Масштабные полоски представляют 1 мм. 6 &quot;Первоначально&quot; / files/ftp_upload/51596/51596fig6highres.jpg &quot;/&gt; Рисунок 6. EDU включение и де СРЕДЫ в эмбрионах зяблик зебры. EDU &quot;нажмите&quot; химия была использована для обнаружения пролиферирующих клеток в стадии 16 22 эмбрионов (А, В, С). ОБР включена в ДНК в месте тимидина 26, 27 и обнаруживается с помощью щелчка химии 27. Пролиферация отчетливо видна в боковых краев сомитов, а также хвостовой почки. Группа показывает пролиферацию, происходящих исключительно в задней части эмбриона, а также показаны отдельные пролиферативные клетки. Панель В показывает пролиферативные места в целом эмбриона. Панель C показывает переднюю область, и показывает весьма пролиферативный конечного мозга (TE) более подробно. Сокращения: AF, амниотической раза; FLB, передних конечностей бутон; HLB, задних конечностей бутон; ле, объектив пузырек; мс, средний мозг; Монтана, Задний мозг; OPC, глазной бокал; годовых, глотки арки; см, сомит мезодерма; ложки, хвостовой почки; Те, конечный мозг. Масштабные полоски представляют 1 мм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51596/51596fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 7" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig7highres.jpg" /> На рисунке 7. Качество РНК, выделенной из вскрытых эмбрионов Zebra Finch. Управления (0.0 м.д.) и 1,2 м.д. эмбрионов метилртути рассекали и быстро замораживали как описано в шаге 3.8. Каждая дорожка показывает РНК, выделенной из двух гомогенизированных эмбрионов из каждой группы обработки.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development at JoVE.com

Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications.

Вскрытие и Downstream Анализ Zebra Finch эмбрионов на ранних стадиях развития

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) has become an increasingly important model organism in many areas of research including toxicology1,2, behavior3, and ...

dissection-downstream-analysis-zebra-finch-embryos-at-early-stages

Research

JoVE Journal

Biology

10.8K Views.  College of William and Mary. The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications. 

Video: Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Препарирование 6,5 Эмбрионы DPC мышь

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Подготовка нейронных культур от Midgastrula этапе эмбрионы дрозофилы

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

Размещение фактор роста покрытием бисер на ранних эмбрионов куриного этап

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Метод культуры раннего куриных эмбрионов исключая виво (Новая Культура)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Дважды Всего горе на месте гибридизация раннего куриных эмбрионов

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Нейронов и астроцитов сотрудничеству культуры Пробирной высоких Анализ содержания Нейротоксичность

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Эффективной и быстрой изоляции на ранней стадии эмбрионы из<em&gt; Arabidopsis THALIANA</em&gt; Семена

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Протокол Lentiviral трансдукции и вниз по течению анализа заболеваемости кишечными органоиды

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus Laevis как модель для идентификации перевода Обесценение

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune system &#8212; such as neutrophils, dendritic cells, and macrophages &#8212; retain the innate ability to detect and clear such invading pathogens through phagocytosis1. Phagocytosis involves choreographed events of membrane reorganization and actin remodeling at the cell surface2,3. Phagocytes successfully internalize and eradicate foreign molecules only when all stages of phagocytosis are fulfilled. These steps include recognition and binding of the pathogen by pattern recognition receptors (PRRs) residing at the cell surface, formation of phagocytic cup through actin-enriched membranous protrusions (pseudopods) to surround the particulate, and scission of the phagosome followed by phagolysosome maturation that results in the killing of the pathogen3,4.
Imaging and quantification of various stages of phagocytosis is instrumental for elucidating the molecular mechanisms of this cellular process. The present manuscript reports methods to study the different phases of phagocytosis. We describe a microscope-based approach to visualize and quantify the binding, phagocytic cup formation, and the internalization of particulate by phagocytes. As phagocytosis occurs when innate receptors on phagocytic cells encounter ligands on a target particle bigger than 0.5 &#181;m, the assays we present here comprise the use of pathogenic fungi Candida albicans and other particulates such as zymosan and IgG-coated beads.

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 &#181;m including zymosan and IgG-coated beads.

Визуальное на ранних стадиях фагоцитоза

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...