Gli autori ringraziano le loro fonti di finanziamento, Howard Hughes Medical Institute di Laurea Scienze della Formazione Programma per il College of William and Mary; Sponsor di Grant: NIH (MSS); Numero di Grant: R15NS067566. Si riconoscono anche il sostegno del College of William and Mary, Dipartimento di Biologia e Collegio delle Arti e delle Scienze per l&#39;assistenza con la cura degli animali.

Etica Dichiarazione: I metodi sono stati condotti con diamanti mandarini addomesticati dalla colonia riproduttiva presso il College of William and Mary. Tutte le procedure seguite linee guida RSPCA 23 e sono stati approvati dal College of William and Mary OLAW (Office of Laboratory Animal Welfare) Animal Welfare Assurance (# A3713-01) e aveva Institutional Animal Care ed uso commissione (IACUC) approvazione (# 2013-06 -02-8721-dacris). 1. Raccolta delle uova e incubazione <ol><li> Stabilire zebra coppie di fringuelli su un 14:10 luce: buio ciclo. Fornire cibo, acqua, fieno, e una cassetta nido ad libitum. Nota: cure di routine e l&#39;allevamento di fringuelli zebra è stata ben descritta 23. </li><li> Preparare un incubatore pulcino di serie con ripiani ribaltabili. Nota: Mantenere l&#39;incubatore artificiale a 37,5 (+ / - 1) ° C con il 80 - 95% umidità aggiungendo acqua al fondo dell&#39;incubatore su base giornaliera. Lasciare l&#39;incubatrice si stabilizzi per due giorniprima di utilizzare. <ol><li> Selezionare piccole tazze di alimentazione (5 x 7,6 centimetri) di almeno 2,5 centimetri di profondità per tenere le uova in incubatrice. Foderare il fondo ei bordi inferiori della tazza con due strati di carta assorbente in modo che la coppa è imbottito, pur consentendo le uova rotolano facilmente. Mettere queste tazze sugli scaffali di oscillazione della incubatrice. Nota: Troppo imbottitura può inibire rotolamento, che impedirà di incubazione successo grazie all&#39;adesione embrionale all&#39;interno della shell. </li></ol></li><li> Raccogliere le uova a due ore dopo l&#39;inizio del ciclo di luce. Nota: Questo riduce al minimo le discrepanze in fase di sviluppo per un determinato tempo di incubazione a causa di incubazione dei genitori. <ol><li> Raccogliere le uova delicatamente con il pollice e l&#39;indice sulla punta e base lungo la lunghezza dell&#39;uovo. Utilizzare un sordo, morbida matita di grafite 4B per etichettare la data prevista e l&#39;ora raccolti dal nido. Nota: La matita 4B morbida riduce il rischio della matita rompere il guscio fragile. </li><li> 1.3.2) Porre 1-5 uova etichettate in ogni cup nell&#39;incubatore modo che le uova possono liberamente rotolare per impedire l&#39;adesione embrionale all&#39;interno del guscio. Nota: Inserendo più di 5 uova in una tazza può impedire di rotolamento delle singole uova e ridurre la vitalità degli embrioni. </li></ol></li></ol> 2. Rimozione di embrioni da Egg <ol><li> Per preparare per la dissezione, assemblare i seguenti materiali: un bisturi pulito, belle pinze a punta, e due belle punta forcipe supplementari. Inserire 10 x 10 cm pesano carta sulla base della portata dissezione per fornire una superficie pulita, non assorbente per dissezione. Nota: La carta pesare è fondamentale perché consente una facile manipolazione del tuorlo ed è la migliore superficie per tagliare le membrane delicate con un bisturi. </li><li> Preparare una aliquota di tampone fosfato salino (PBS 1X) in una provetta di polipropilene da 50 ml, e acquisire almeno tre pipette di trasferimento e un piccolo secchio rifiuti. Se fissa gli embrioni, preparare una aliquota del 4% paraformaldeide (PFA). Attenzione: i vapori PFA sono tossici, und tutti i passaggi che coinvolgono PFA dovrebbe essere fatto all&#39;interno di una cappa di aspirazione per ridurre al minimo l&#39;esposizione. Se il flash congelare gli embrioni, ottenere azoto liquido e tenerlo vicino al campo di applicazione dissezione. La sterilità non è un problema per questo protocollo dissezione, ma garantire che tutti i materiali siano puliti. </li><li> Rimuovere l&#39;uovo dal termostato al punto tempo necessario per la fase desiderata come descritto nel diamante mandarino guida staging 22. Nota: Rimuovere le uova dopo 36 ore di incubazione a sezionare fase 6 embrioni (Figura 4A) 22 e rimuovere le uova, dopo 56 ore di incubazione a sezionare fase 12 embrioni (figura 3A) 22. </li><li> Utilizzando una lampada a fibre ottiche illuminatore, candela l&#39;uovo tenendolo lungo il suo asse verticale e la luce risplenda attraverso l&#39;uovo per illuminare l&#39;interno. Posizionare la punta del leggero dietro l&#39;uovo e il tuorlo e localizzare embrioni. <ol><li> Posizionare il bisturi sul lato opposto il tuorlo e tagliare lungo l&#39;uovo da punta abase con debole pressione. </li></ol></li><li> Rimuovere il contenuto dell&#39;uovo applicando accuratamente pressione sulla punta e base dell&#39;uovo con il pollice e l&#39;indice, o leva delicatamente a parte il guscio lungo il taglio con una pinza. Aprire l&#39;uovo direttamente sopra la carta pesare in modo che il tuorlo rotola delicatamente. </li><li> Esaminare il tuorlo per la zona bianca di svincolo, che è visibile come un anello bianco debole che circonda lo sviluppo embrionale e orientare il tuorlo con finissima punta pinza in modo che l&#39;embrione si trova nel centro. Nota: Se un cerchio bianco debole sulla superficie del tuorlo non si osserva, prendere le pinza sottile e delicatamente rotolare sopra il tuorlo finché l&#39;embrione è sopra il tuorlo. Nota: Per i punti 1 - 9 22, il disco embrionale è minore di 6 mm di diametro ed è visibile come una debole, disco leggermente opaco sulla superficie del tuorlo - vedere la Figura 1 per riferimento. Per le fasi 10 e 22 anziani, pozze di sangue permettono migliorato visibility dell&#39;embrione, ma fare attenzione a evitare la puntura del sacco vitellino, in quanto ciò rende localizzare l&#39;embrione difficile. </li></ol> 3. Separazione di embrioni da tessuto extra-embrionali <ol><li> Forare i bordi del tuorlo per alleviare la pressione (Figura 1B), ed effettuare tagli singoli tutta la lunghezza del diametro tuorlo fianco del disco embrionale. Ripetere rendendo queste linee diagonali finché la sezione del tuorlo contenente l&#39;embrione è stato separato con successo (Figura 1B). Nota: Questa fase consente la massa tuorlo di rimanere intatto, ma la pressione ridotta sulla superficie del tuorlo consente una maggiore precisione nel taglio intorno l&#39;embrione, evitando danni alle strutture embrionali. </li><li> Rimuovere i bordi del tuorlo con una pipetta di trasferimento. Nota: rimuovere il più possibile tuorlo, ma lasciare una piccola quantità in modo che l&#39;embrione non aderisce alla superficie secca della carta pesare e strappo. </li><li> Lavare il disco embrionale da Dispenszione 1X PBS a 45 ° verso il basso dell&#39;embrione. Posizionare la punta della pipetta di trasferimento accanto-non sopra il disco embrionale. Se esigenze tuorlo aggiuntivi da rimuovere, separare ogni tuorlo con il bisturi sulla carta pesare prima di trasferire l&#39;embrione alla piastra di Petri. Nota: Questo metodo rimuove l&#39;embrione dalla superficie della carta pesare. </li><li> Trasferire l&#39;embrione utilizzando una pipetta di trasferimento con un volume minimo di 1X PBS per un piccolo, piatto di plastica Petri. Lavare l&#39;embrione aggiungendo più 1X PBS nel piatto di Petri e grondante 1X PBS vicino, ma non direttamente, l&#39;embrione. Agitare la piastra di Petri per lavare e rimuovere il tuorlo residuo, inclinare il piatto di Petri, e rimuovere i rifiuti 1X PBS con la pipetta di trasferimento. NOTA: Quando la 1X PBS viene rimosso, l&#39;embrione tipicamente non aderisce al fondo del piatto Petri perché la superficie plastica è scivoloso con residuo 1X PBS. Tuttavia, più 1X PBS può essere aggiunta se l&#39;embrione si attacca al piatto. Se il fissaggio tegli embrioni, seguire i passaggi 3.5 e 3.6. Se il flash congelamento dell&#39;embrione, passare al punto 3.8 immediatamente. </li><li> Se fissa l&#39;embrione di ibridazione in situ, aggiungere subito 4% PFA per il piatto di Petri per sommergere l&#39;embrione. Gocciolare 4% PFA direttamente sulla parte superiore della dell&#39;embrione per appiattirlo; questo impedisce l&#39;embrione da curling. Fissare l&#39;embrione nel 4% PFA a 4 ° C per 12 ore. <ol><li> Dopo la fissazione, disidratazione embrioni in soluzioni (MeOH) e conservare a -20 ° C in 100% di metanolo metanolo classificato. </li></ol></li><li> Se l&#39;embrione è tra gli stadi 1-8 22, rimuovere la membrana vitellina aderito l&#39;embrione. Nota: Questa fase può essere eseguita durante o dopo il fissaggio. Embrioni di età inferiore ai tappa 8 22 non sono facilmente visualizzati perché aderiscono alla membrana vitellina, oscurando le strutture chiave, come si vede nella figura 2A. <ol><li> Afferrare il bordo della membrana che si estende oltre la zona di giunzione con pinza extra fini. Carefully capovolgere l&#39;embrione su più volte per lavare via granuli tuorlo residue e per allentare l&#39;aderenza del disco embrionale alla membrana vitellina. Nota: Non toccare il centro dell&#39;embrione, in quanto questo potrebbe danneggiare le strutture embrionali. </li><li> Se il divario non sembra tra la zona di giunzione e la membrana vitellina, delicatamente graffiare la zona di congiunzione con la multa supplementare punta pinze per allentarla dalla membrana vitellina. Afferrare la membrana vitellina con la multa supplementare punta pinza e tirare delicatamente dalla dell&#39;embrione. Se necessario, tirare delicatamente l&#39;embrione dalla membrana vitellina afferrando il bordo periferico del disco embrionale in corrispondenza della zona di giunzione. </li><li> Gettare la membrana vitellina di rischio biologico 1 rifiuti (livello di biosicurezza 1) dopo la rimozione. </li></ol></li><li> Quando si esegue un saggio ISH sui giovani stadi embrionali, seguire protocolli standard intere mount ISH di embrioni di pollo 24, 25, ma prendere in considerazione i seguenti suggerimenti. <ol&gt; <li> Per ridurre i danni agli embrioni durante la procedura di ISH, utilizzare una sola fiala di vetro da 5 ml con tappo a vite per ogni embrione. Compilare solo flaconcini con 2-3 ml di soluzione, assicurando che gli embrioni siano completamente sommersi. Fiale Nutate verticalmente, ponendo 5 ml fiale in un rack di polistirolo (o qualsiasi rack che non mancherà di tenere i flaconi sicuro) che è fissato a un nutator. Nota: Questa precauzione impedisce l&#39;embrione da lacerazione, che può verificarsi quando viene a contatto con il coperchio della fiala durante nutazione orizzontale. </li><li> Per gli embrioni fase 0-6 22, il trattamento con 5 mg / ml proteinasi K in 1X PTW per 5 minuti a temperatura ambiente. Trattare embrioni scena 7-12 22 con 10 ug / ml di proteinasi K in 1X PTW per 10 min a 37 ° C per ridurre la colorazione di fondo. </li><li> Per produrre una reazione di colore sufficiente a rilevare i bassi livelli di espressione genica nelle fasi 1-10 22, incubare con una concentrazione sonda 10 mcg / ml per 12 ore. Per le fasi più anziani, incubare con 1 &amp; #956; g / ml concentrazione sonda a 60 ° C. </li></ol></li><li> Se-flash congelamento dell&#39;embrione, aggiungere rapidamente 2-3 ml di PBS 1X per il piatto di Petri seguente dissezione e inclinare il piatto di Petri per separare l&#39;embrione dai granuli tuorlo. Rimuovere il liquido e ripetere 2 - 3 volte per rimuovere tutti tuorlo. Utilizzando fine punta pinze, trasferimento di embrioni in una provetta pre-etichettati e flash congelare in azoto liquido prima di riporre a -80 ° C. </li></ol> 4. EdU Cell Proliferation Assay. Costituzione e Rilevamento di EdU in Zebra Finch embrioni. <ol><li> Candela l&#39;uovo usando una lampada a fibre ottiche illuminatore per individuare l&#39;embrione o tuorlo. </li><li> Contrassegnare il lato dell&#39;uovo opposto alla posizione dell&#39;embrione o tuorlo nell&#39;uovo per garantire che l&#39;embrione non è danneggiato durante il processo di microiniezione. </li><li> Linea un piatto di plastica 60 mm Con plastilina e stampo nella forma di una ciotola di tenere l&#39;uovo con l&#39;orientamento desiderato. Lo spot marcato dovrebbe essereorientata per consentire l&#39;inserimento dell&#39;ago microiniezione utilizzando micromanipolatore. Nota: L&#39;argilla si stabilizzerà l&#39;uovo durante microiniezione e durante l&#39;incubazione nel passaggio 4.11. </li><li> Tirare due aghi microiniezione capillari di vetro. Blunt un ago per fare un buco nell&#39;uovo al punto marcato. Preparare il secondo ago microiniezione per l&#39;iniezione da backloading con olio minerale e inserirla nel microinjector. </li><li> Impostare il volume della soluzione rilasciato per iniezione a 59,8 nl sulla microinjector. </li><li> Caricare l&#39;ago microiniezione con il 10 mM soluzione madre EdU. </li><li> Creare un foro nel guscio sul punto marcato con il capillare di vetro smussata, facendo attenzione a non rompere il guscio o far cadere i pezzi del guscio nella cavità uovo. Orientare l&#39;uovo in modo che il foro è ad un angolo di 45 °, consentendo l&#39;ago microiniezione da inserire direttamente attraverso la cavità al tuorlo o embrione. </li><li> Utilizzando il micromanipolatore, inserire laloaded ago Circa 1.0 cm nel cavità. </li><li> Iniettare la quantità desiderata di soluzione EdU direttamente sullo sviluppo dell&#39;embrione o tuorlo. Nota: Un massimo di 478 nl di EdU può essere iniettato con conseguente morte embrionale. </li><li> Subito avvolgere l&#39;uovo e il supporto di argilla con più strati di pellicola trasparente per coprire l&#39;uovo e il piatto per prevenire l&#39;essiccamento dell&#39;embrione durante l&#39;incubazione. Tape i bordi della plastica avvolgono al fondo del piatto per evitare la plastica da scartare durante l&#39;incubazione. Nota: L&#39;involucro di plastica deve essere rimosso solo immediatamente prima dissezione. </li><li> Permettono alle cellule proliferanti giudicato a recepire la EdU incubando l&#39;uovo a 37 ° C fino al raggiungimento della fase desiderata. Dopo l&#39;iniezione, non ritorno uovo di ribaltamento ripiani in incubatrice. Posizionare l&#39;argilla piatto rivestito di plastica avvolto su una superficie stabile all&#39;interno dell&#39;incubatrice. </li><li> Rimuovere l&#39;involucro di plastica e sezionare l&#39;embrione seguendo il protocollo di cui sopra.Fissare l&#39;embrione in 4% PFA e incubare 12 ore a 4 ° C come sopra descritto. Dopo la fissazione, lavare con 100% di etanolo (EtOH) per 5 min e conservare in fresco 100% EtOH a -20 ° C fino ad ulteriore analisi. </li></ol> 5. EdU &quot;clic&quot; Protocollo di Reazione Le seguenti operazioni sono tutte eseguite in flaconcini di vetro. <ol><li> Reidratare embrioni con successivi 5 min lavaggi di quanto segue: </li><li> EtOH, 75% EtOH e 25% deionizzata sterile distillata (SDD) acqua, 50% EtOH e acqua sdd 50%, 25% EtOH e 75% 1X PTW, 100% 1X PTW </li><li> Lavare tre volte in 100% 1X PTW per 10 minuti ciascuno. </li><li> Diluire l&#39;additivo tampone di reazione (Kit Component F) combinando 1 parte della soluzione tampone di 10 volte (10 ml) a 9 parti di SDD acqua (90 ml). </li><li> Preparare la miscela di reazione in un tubo separato miscelando il seguente: 875 microlitri 1X PBS, 20 microlitri CuSO 4, 5 microlitri azide, 100 microlitri diluito additivo tampone di reazione.Nota: Volume della miscela di reazione può essere ridotta. La reazione funziona se l&#39;embrione è completamente coperto nella miscela di reazione. Aggiungere l&#39;additivo tampone di reazione diluita (passo 5.3) immediatamente prima dell&#39;uso. Tutte le fasi successive vengono eseguite al buio. Coprire gli embrioni con un foglio per proteggere dalla luce. </li><li> Coprire le fiale con un foglio di alluminio, e incubare verticalmente a temperatura ambiente per due ore mettendoli in un rack di polistirolo attaccato ad un nutator. </li><li> Lavare gli embrioni 3 volte in fresco 1X PBS per 10 min ciascuno. </li><li> Incubare gli embrioni in fresco 4% PFA notte a 4 ° C. </li><li> Lavare 3 volte in PBS 1X per 10 min ciascuno e conservare fresca 1X PBS a 4 ° C. Coprire gli embrioni con un foglio fino a ulteriori analisi. </li></ol>

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	<li>Eng, M. L., Elliott, J. E., MacDougall-Shackleton, S. A., Letcher, R. J., Williams, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+exposure+to+2,2',4,4',5-pentabromodiphenyl+ether+(BDE-99)+affects+mating+behavior+of+zebra+finches.">Early exposure to 2,2',4,4',5-pentabromodiphenyl ether (BDE-99) affects mating behavior of zebra finches.</a> Toxicol Sci. 127, 269-276 (2012).</li><li>Winter, V., Elliott, J. E., Letcher, R. J., Williams, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+an+egg-injection+method+for+embryotoxicity+studies+in+a+small,+model+songbird,+the+zebra+finch+(Taeniopygia+guttata).">Validation of an egg-injection method for embryotoxicity studies in a small, model songbird, the zebra finch (Taeniopygia guttata).</a> Chemosphere. 90, 125-131 (2013).</li><li>Maney, D. L., Goodson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenomic+mechanisms+of+aggression+in+songbirds.">Neurogenomic mechanisms of aggression in songbirds.</a> Adv Genet. 75, 83-119 (2011).</li><li>Kirn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+of+neurogenesis+and+growth+of+brain+regions+to+song+learning.">The relationship of neurogenesis and growth of brain regions to song learning.</a> Brain and Language. 115, 29-44 (2010).</li><li>Fisher, S. E., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXP2+as+a+molecular+window+into+speech+and+language.">FOXP2 as a molecular window into speech and language.</a> Trends in Genetics. 25, 166-167 (2009).</li><li>Tokarev, K., Tiunova, A., Scharff, C., Anokhin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+for+Song:+Expression+of+C-Fos+and+ZENK+in+the+Zebra+Finch+Song+Nuclei+during+Food+Aversion+Learning.">Food for Song: Expression of C-Fos and ZENK in the Zebra Finch Song Nuclei during Food Aversion Learning.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Vargha-Khadem, F., Gadian, D. G., Copp, A., Mishkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXP2+and+the+neuroanatomy+of+speech+and+language.">FOXP2 and the neuroanatomy of speech and language.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 131-138 (2005).</li><li>Schulz, S. B., Haesler, S., Scharff, C., Rochefort, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+FoxP2+alters+spine+density+in+Area+X+of+the+zebra+finch.">Knockdown of FoxP2 alters spine density in Area X of the zebra finch.</a> Genes, Brain and Behavior. 9, 732-740 (2010).</li><li>Jarvis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+brains+and+a+new+understanding+of+vertebrate+brain+evolution.">Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 151-159 (2005).</li><li>Brainard, M. S., Doupe, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+birdsong:+songbirds+as+a+model+for+basic+applied+medical+research.">Translating birdsong: songbirds as a model for basic applied medical research.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 489-517 (2013).</li><li>Mayer, U., Watanabe, S., Bischof, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+memory+and+the+avian+hippocampus:+Research+in+zebra+finches.">Spatial memory and the avian hippocampus: Research in zebra finches.</a> J Physiol Paris. , (2012).</li><li>Warren, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+a+songbird.">The genome of a songbird.</a> Nature. 464, 757-762 (2010).</li><li>Agate, R. J., Scott, B., Haripal, B., Lois, C., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+songbirds+offer+an+opportunity+to+develop+a+genetic+model+for+vocal+learning.">Transgenic songbirds offer an opportunity to develop a genetic model for vocal learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17963-17967 (2009).</li><li>Birkhead, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+incubation+and+early+hatching+in+brood+parasitic+birds.">Internal incubation and early hatching in brood parasitic birds.</a> Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 278, 1019-1024 (2011).</li><li>Haesler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxP2+expression+in+avian+vocal+learners+and+non-learners.">FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners.</a> J Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).</li><li>Godsave, S. F., Lohmann, R., Vloet, R. P. M., Gahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+receptors+in+the+embryonic+zebra+finch+hindbrain+suggest+a+function+for+maternal+androgens+in+perihatchingsurvival.">Androgen receptors in the embryonic zebra finch hindbrain suggest a function for maternal androgens in perihatchingsurvival.</a> Journal of Comparative Neurology. 453, 57-70 (2002).</li><li>Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick;+a+great+model+system+becomes+even+greater.">The chick; a great model system becomes even greater.</a> Dev Cell. 8, 9-17 (2005).</li><li>Kuenzel, W. J., Medina, L., Csillag, A., Perkel, D. J., Reiner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+avian+subpallium:+new+insights+into+structural+and+functional+subdivisions+occupying+the+lateral+subpallial+wall+and+their+embryological+origins.">The avian subpallium: new insights into structural and functional subdivisions occupying the lateral subpallial wall and their embryological origins.</a> Brain Research. 1424, 67-101 (2011).</li><li>Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+chicken+embryology+to+the+understanding+of+vertebrate+limb+development.">The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development.</a> Mech Dev. 121, 1019-1029 (2004).</li><li>Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rediscovering+the+chick+embryo+as+a+model+to+study+retinal+development.">Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development.</a> Neural Development. 7, (2012).</li><li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development.">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenet Genome Research. 117, 231-239 (2007).</li><li>Murray, J. R., Varian-Ramos, C. W., Welch, Z. S., Saha, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryological+staging+of+the+zebra+finch,+Taeniopygia+guttata.">Embryological staging of the zebra finch, Taeniopygia guttata.</a> J Morphol. , (2013).</li><li>Hawkins, P., Morton, D. B., Cameron, D., Cuthill, I., Francis, R., Freire, R., Gosler, A., Healy, S., Hudson, A., Inglis, I., Jones, A., Kirkwood, J., Lawton, M., Monaghan, P., Sherwin, C., Townsend, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+birds:+refinements+in+husbandry+and+procedures.+Fifth+report+of+BVAAWF/FRAME+/RSPCA/UFAW+Joint+Working+Group+on+Refinement.">Laboratory birds: refinements in husbandry and procedures. Fifth report of BVAAWF/FRAME /RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement.</a> Lab Anim. , (2001).</li><li>Pearse II, R. V., Esshaki, D., Tabin, C. J., Murray, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+expression+analysis+of+intra-+and+extraarticular+connective+tissue.">Genome-wide expression analysis of intra- and extraarticular connective tissue.</a> Journal of Orthopaedic Research. 27, 427-434 (2009).</li><li>Pizard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridization+and+detection+of+RNAs+in+vertebrate+embryos+and+isolated+organs.">Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 66, (2004).</li><li>Warren, M., Puskarczyk, K., Chapman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+proliferation+studies+using+EdUlabeling.">Chick embryo proliferation studies using EdUlabeling.</a> Developmental Dynamics. 238, 944-949 (2009).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+syntesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA syntesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Hoogesteijn, A. L., DeVoogd, T. J., Quimby, F. W., De Caprio, T., Kollias, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+impairment+in+zebra+finches+(Taeinopygia+guttata).">Reproductive impairment in zebra finches (Taeinopygia guttata).</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 24, 219-223 (2005).</li><li>Winter, V., Williams, T. D., Elliott, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-generational+study+of+In+ovo+exposure+to+PBDE-99+in+the+zebra+finch.">A three-generational study of In ovo exposure to PBDE-99 in the zebra finch.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 32, 562-568 (2013).</li><li>Kitulagodage, M., Buttemer, W. A., Astheimer, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adverse+effects+of+fipronil+on+avian+reproduction+and+development:+maternal+transfer+of+fipronil+to+eggs+in+zebra+finch+Taeinopygia+guttata+and+in+ovo+exposure+in+chickens+Gallus+domesticus.">Adverse effects of fipronil on avian reproduction and development: maternal transfer of fipronil to eggs in zebra finch Taeinopygia guttata and in ovo exposure in chickens Gallus domesticus.</a> Ecotoxicology. 20, 653-660 (2011).</li><li>Hallinger, K. K., Zabransky, D. J., Kazmer, K. A., Cristol, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birdsong+differs+between+mercury-polluted+and+reference+sites.">Birdsong differs between mercury-polluted and reference sites.</a> The Auk. 127, 156-161 (2010).</li><li>Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioactive+in+situ+Hybridization+for+Detecting+Diverse+Gene+Expression+Patterns+in+Tissue.">Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li><li>Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+Avian+Brain+Chimeras+Reveal+That+Large+Brain+Size+Differences+Are+Influenced+by+Cell&#8211;Interdependent+Processes.">Interspecies Avian Brain Chimeras Reveal That Large Brain Size Differences Are Influenced by Cell&#8211;Interdependent Processes.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Chen, C. C., Winkler, C. M., Pfenning, A. R., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+the+developing+avian+telencephalon:+Regional+timing+and+brain+subdivision+continuities.">Molecular profiling of the developing avian telencephalon: Regional timing and brain subdivision continuities.</a> The Journal of Comparative Neurology. 521, 3666-3701 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Recenti sviluppi di una guida messa in scena embrionale 22 e annotazione del genoma rendono il diamante mandarino organismo modello auspicabile per studi sullo sviluppo. Tuttavia, le piccole dimensioni e la fragilità degli embrioni Zebra Finch, che vanno 3-7 mm fasi 1-10 22, possono rendere difficile dissezioni 11, 14. Individuazione e rimozione pulita embrioni dalla superficie del tuorlo può essere impegnativo. Questo protocollo fornisce dettagli sufficienti per eseguire la procedura con facilità. Questo protocollo dimostra i passaggi critici che non sono in genere conosciuti, ma sono necessarie per garantire una dissezione di successo. Ad esempio, è indispensabile lasciare un piccolo strato di tuorlo tra l&#39;embrione e foglio di carta pesare escludere attaccare. Sia l&#39;identificazione e la rimozione dell&#39;embrione può essere difficile. Per risolvere identificare l&#39;embrione sulla superficie del tuorlo, brillare luce direttamente sopra il tuorlo dopo hastato rimosso dal uovo, e guardare il tuorlo con un angolo di 45 ° per trovare l&#39;embrione. Una volta che l&#39;embrione si trova, tagliare il tuorlo pesare sulla carta avendo cura di non strappare l&#39;embrione. Se ulteriori applicazioni includono imaging per differenze anatomiche, ibridazione in situ, o saggi di proliferazione cellulare, è importante rimuovere la membrana vitellina in fase 1 - 8 22 per una migliore visualizzazione delle strutture. Se in difficoltà quando si rimuove il tuorlo o la membrana vitellina nelle fasi iniziali, fissare l&#39;embrione nel 4% PFA prima di lavare in PBS 1X per ridurre la fragilità embrionale. Rimuovendo prima la membrana vitellina durante la dissezione come descritto, le strutture sono chiaramente visibili e intatto nel zebra embrioni fringuelli dopo l&#39;esecuzione di ibridazione in situ. Una limitazione di EdU è che la somministrazione di volumi di dosaggio su 478 conduce nl a fatalità embrionale. Tuttavia, la vasta gamma di dosaggio permette varying livelli di marcatura delle cellule proliferative. La reazione &quot;click&quot; utilizzato in questo kit è il rame (I) catalizzata-Alkyne-azide-cicloaddizione (Cu (I) AAC). In questa reazione specifica, una molecola analogo della timidina-alchino contenente (UDE) viene incorporato dividendo attivamente cellule. Il gruppo alchino nel EdU sporge dalla struttura elicoidale del DNA, e viene rilevato mediante esposizione a una molecola azide coniugato ad una molecola verde fluorescente che si lega al gruppo alchino libero. La fluorescenza verde mostra le nuove cellule proliferanti nell&#39;embrione. La bio-ortogonalità del azide e gruppi alchini impedisce la colorazione non specifica perché queste specie reattive non sono naturalmente presenti negli organismi. Inoltre, poiché il DNA non deve essere denaturato in modo che la reazione avvenga, ulteriori analisi DNA-dipendente può essere facilmente eseguita 27. Una limitazione intrinseca di questo metodo è la piccola dimensione e frammentazioneilità di zebra embrioni fringuelli. Rimozione della membrana vitellina di embrioni fasi 1-15 22 può portare a strutture embrionali dannosi se non eseguita con cautela. Tuttavia, questo protocollo semplifica il metodo di dissezione, permettendo che i ricercatori utilizzano primi stadi embrionali esaminare anomalie strutturali e di espressione genica che non sono stati studiata in precedenza. Questo protocollo apre la strada per una pletora di saggi cellulari-molecolari che permetteranno ai ricercatori di determinare le origini dello sviluppo di fenotipi adulti. Ad esempio, sarà possibile esaminare l&#39;espressione del gene implicato nella formazione vocale in varie condizioni ambientali oa seguito di trattamenti farmacologici nelle primissime fasi di sviluppo 28, 29,30,31. Anche se non è dimostrato in questo documento, questo metodo consente potenzialmente di altre procedure, come radioattivo ibridazione in situ su sezioni di tessuto zebra Finch e elettroporazione / a ovo chirurgia 32, 33,34. Dato che il diamante mandarino è stata stabilita come un importante organismo modello all&#39;interno di un vasto corpo di letteratura, questi studi forniscono opportunità non sfruttate per collegare meccanismi di sviluppo con la fisiologia e del comportamento degli adulti, in particolare lo sviluppo del linguaggio 7, 9.

L&#39;obiettivo generale di questa tecnica è quello di ottenere zebra Finch (Taeniopygia guttata) embrioni dalle prime fasi dell&#39;embriogenesi per l&#39;uso in una vasta gamma di studi sullo sviluppo. Zebra finch sono diventati il modello predominante songbird organismo e sono stati ampiamente utilizzati in una varietà di settori, tra cui tossicologia 1,2, comportamento 3, la memoria e l&#39;apprendimento 4,5,6, neuroanatomia comparata 7,8 e lo sviluppo del linguaggio 9,10 . Come l&#39;unico uccello canterino con un genoma sequenziato, il diamante mandarino permette lo studio molecolare e genetico dell&#39;ordine Passeriformi, che rappresenta oltre il 50% delle specie di uccelli conosciute 11, 12,13. Nonostante l&#39;uso di adulto e giovanile Zebra Finch in una gamma diversificata di settori, pochi studi sono stati condotti su embrioni Zebra Finch, soprattutto durante le prime fasi di sviluppo. Questo può essere attribuito al limitato numero di uovand embrioni, e il loro stato più recente come organismo modello 14,15,16 per gli studi in cui il pollo (Gallus gallus domesticus) è stato precedentemente utilizzato come 17,18,19,20,21 sistema modello predominante. Tuttavia, come gli studenti non-vocali, i polli non sono un sistema modello adeguato per lo studio della base genetica di apprendimento vocale, sviluppo della formazione vocale, ereditarietà, il comportamento e la circuiteria gangli cortico-basale coinvolti in apprendimento motorio 10. E &#39;importante notare che gli embrioni Zebra Finch sono molto più delicate e più facilmente danneggiabili di embrioni di pollo durante la dissezione e le procedure molecolari. In particolare, maggiore attenzione è necessaria quando si eseguono operazioni di permeabilizzazione su zebra embrioni fringuello. Forti detergenti ed enzimi che non danneggiare un embrione di pulcino possono danneggiare zebra embrioni fringuello. In termini di cura generale, è necessario mettere zebra fringuelli uova in piccole tazze prima del posizionamento in un incubatoreper evitare che si rompano durante il rotolamento durante l&#39;incubazione. Zebra finch sono suscettibili di studi comportamentali, facile e prolifico razza per tutto l&#39;anno in cattività, e sono gli studenti vocali. Queste caratteristiche permettono l&#39;uso del diamante mandarino per affrontare la necessità di un organismo modello che integra lo sviluppo, la genetica, e aspetti comportamentali del linguaggio. I metodi dissezioni descritte di seguito, in combinazione con una guida messa in scena recentemente sviluppato specifico zebra finch 22, rendono il diamante mandarino un sempre più utile standardizzato modello di sviluppo dell&#39;organismo. Tuttavia, ottenere embrioni nelle fasi iniziali può essere scoraggiante. Questo protocollo consente agli investigatori di ottenere facilmente embrioni in fase iniziale. Gli studi che indagano lo sviluppo precoce e la base dello sviluppo molecolare di comportamenti complessi in diamante mandarino, o gli effetti tossicologici sullo sviluppo in altri piccoli uccelli passeriformi troveranno questa metodologia dissezione utile.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chicken egg incubator</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">We use a Picture Window Hova-Bator Incubator, Circulated Air Model&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10337</td>
			<td>Detection of cell proliferation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use Olympus SZ61</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7&#39;&#39; Drummond capillary for Nanoject II injector</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-00-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drummond Nanoject II microinjector</td>
			<td colspan="2">Drummond</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont Tweezers #55</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td align="right">14099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL Falcon tube (polypropylene)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-443-18&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastPrep Lysis Matrix H tubes</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>6917-100</td>
			<td>Used for RNA extraction, used to homogenize embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber optic illuminator lamps (High Intensity Illuminator)</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries&#160;</td>
			<td colspan="2">Fiber-Lite MI-150&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass vials with screw cap (DEPC treated)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge eppe tube (1.5 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Modeling Clay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Narshige PB-7 needle puller</td>
			<td>Narshige</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Omni Bead Ruptor Homogenizer</td>
			<td style="width:71px;">OMNI International</td>
			<td>19-010</td>
			<td>Used for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="3" height="25" style="height:25px;">4% Paraformaldehyde (4% PFA): 20 mL 8% PFA (32g paraformaldehyde, 350mL sdd H2O, adjust pH to 7.6, 400mL sdd H2O), 20mL 2xPBS</td>
			<td>Fixation of embryos. Caution, is harmful and do not inhale.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="4" height="25" style="height:25px;">Phosphate buffered saline (1xPBS): 200mL 10X PBS, 1800 mL Barnstead H2O, adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="4" height="25" style="height:25px;">Phosphate buffered saline (10xPBS): 800mL Barnstead, 2.013g KCL, 80.063g NaCl, 2.722g KH2PO4 monobasic, 14.196g Na2HPO4 dibasic, 200mL Barnstead H2O, adjust pH to 6.5</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="4" height="25" style="height:25px;">Phosphate buffered saline with 0.1% Tween-20 (1xPTw): 1800mL Barnstead H2O, 200mL 10X PBS, adjust pH to 7.4, 2mL Tween-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35mL Plastic petri dish&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plastic wrap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prepease RNA Spin Kit</td>
			<td>PrepEase, Affymetrix</td>
			<td>78766 1 KT</td>
			<td>Used for RNA extraction, used to homogenize embryos</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Reaction Mix: 875&#956;L 1xPBS, 100mM 20&#956;L CuSO4 (Kit Component E), 5&#956;L Alexa Fluor 488 azide (Kit Component B), 100&#956;L diluted reaction buffer additive (Kit Component F)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10337</td>
			<td>Detection of cell proliferation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">sdd H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seed cup&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use it as a container when incubating eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel scalpel&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard nest box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use Abba Plastic Finch Nestboxes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">4mL, Teflon Lined Cap, Glass Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-912-352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer pipettes (polyethylene)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4x4 weigh paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-898-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and downstream analysis of zebra finch embryos at early stages of development

Il diamante mandarino (Taeniopygia guttata) è diventato un sempre più importante organismo modello in molti settori della ricerca, tra cui tossicologia 1, 2, 3 comportamenti, e la memoria e l&#39;apprendimento 4,5,6. Come l&#39;unico uccello canterino con un genoma sequenziato, il fringuello zebra ha un grande potenziale per l&#39;utilizzo in studi di sviluppo; tuttavia, le prime fasi di sviluppo zebra Finch non sono stati studiati. Mancanza di ricerca in zebra sviluppo Finch può essere attribuito alla difficoltà di sezionare il piccolo uovo e embrione. Il seguente metodo dissezione minimizza i danni tessuto embrionale, che consente di indagine della morfologia e l&#39;espressione genica in tutte le fasi di sviluppo embrionale. Questo permette sia in campo chiaro e fluorescenza imaging di qualità di embrioni, l&#39;uso in procedure molecolari come ibridazione in situ (ISH), saggi di proliferazione cellulare, e l&#39;estrazione di RNA per analisi quantitative come rea quantitatival-time PCR (qtRT-PCR). Questa tecnica permette investigatori di studiare prime fasi di sviluppo che prima erano di difficile accesso.

I passi diagrammed nella figura 1 indicano l&#39;aspetto dell&#39;embrione mentre collegato alla membrana vitellina (A) e dimostrare il corretto metodo per separare l&#39;embrione dal tuorlo (B). L&#39;embrione può essere identificato dalla zona di giunzione, che è molto più leggero la membrana vitellina. L&#39;embrione è spesso difficile distinguere finché il tuorlo è tagliato via. Una volta che l&#39;embrione è sezionato dall&#39;uovo, può essere fisso o Flash congelati per un uso futuro. Se l&#39;ibridazione in situ è prevista per l&#39;embrione sezionato, è necessario rimuovere la membrana vitellina che si aderisce all&#39;embrione attraverso la zona di giunzione. Figura 2 illustra la migliore visibilità dell&#39;embrione appena questa membrana viene rimossa (C), e il modo corretto di sbucciare la membrana vitellina (A, B). Dopo dissezione e fissazione, tutta montare ibridazione in situ è stata eseguita come illustrato nella Figura 3 (A, A &#39;, B, B&#39;) E la figura 4 (A, A&#39;, B, B &#39;) e Figura 5 (A, B, C) ​​per rilevare le differenze di orthodenticle homeobox 2 (Otx2) espressione in embrioni evolutivamente esposti a basse dosi di metilmercurio. Figura 5 mostra Risultati della sonda senso, dimostrando la mancanza di sfondo. In Figura 4, pur essendo sezionato dall&#39;uovo nello stesso punto temporale, l&#39;embrione evolutivamente esposta al metilmercurio (metilmercurio) progredito a fase 5 22 (B, B &#39;), mentre l&#39;embrione controllo sviluppato alla fase 6 22 (A, A &#39;). Il gruppo di embrioni sezionato e mostrato in figura 4 sono stati raccolti dal nido e portato dal termostato alla stessa ora. Anche se alcuni variazione naturale è presente in fase di sviluppo, sulla base dei dati di dissezione precedenti, è improbabile che le fluttuazioni di temperatura nell&#39;incubatrice comporti solo 2,4 ppm embrioni metilmercurio di essere svipmentally ritardo. Le differenze nelle fasi indicano cambiamenti nella proliferazione cellulare in embrioni evolutivamente esposti a metilmercurio. Prima di dissezione, EdU è stato iniettato in una giornata 2 uovo e permesso di incubare una notte. Dopo dissezione e fissazione dello stadio 16 22 embrione, EdU viene visualizzata utilizzando &quot;click&quot; chimica, permettendo la rilevazione di cellule proliferanti, come mostrato nella Figura 6 (A, B, C). E &#39;importante monitorare con attenzione i punti di tempo in cui collocare le uova in incubatrice e durante dissezioni, come l&#39;esposizione al metilmercurio o eseguire il test EdU può interrompere la progressione evolutiva. La prima iniezione è stata eseguita il giorno 0, che era il giorno di raccolta come specificato nel passo 1.3. Questo embrione è stato sezionato circa 38 ore più tardi (fase 7, 22). Il tasso di sopravvivenza è risultata essere di circa il 90% (stessa velocità di embrioni di controllo) finché la quantità di iniezione era sotto 478 nl. 22 embrioni, una estrazione dell&#39;RNA è stata eseguita secondo il protocollo del produttore senza ottimizzazione necessaria, come si vede nella Figura 7. La rimozione della membrana vitellina era necessaria per l&#39;estrazione dell&#39;RNA e successive applicazioni qRT-PCR. Nota: Le cifre embrioni sono orientate in modo che le regioni anteriore e posteriore sono nella parte superiore e inferiore delle immagini, rispettivamente. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig1highres.jpg" /> Figura 1. Procedura per l&#39;individuazione e sezionare embrioni Zebra Finch, mette in scena 1-10 22. Individuare embrione facendo rotolare delicatamente il tuorlo fino a quando il disco bianco debole è evidente (A). Una volta che l&#39;embrione si trova al centro del tuorlo, il tuorlo è sezionato in modo graduale (B) in cui il primo taglio riduce la pressione della membrana vitellina (1) e tagli successivi (2) delimitare la zona di giunzione (zj) che è aderito alla membrana vitellina. Barre di scala rappresentano 1 mm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig2highres.jpg" /> Figura 2. Rimozione di membrana vitellina e la visibilità delle strutture embrionali. Dopo la rimozione di un embrione dal tuorlo, posto embrione in una capsula di Petri contenente 4% PFA. Se l&#39;ibridazione in situ deve essere eseguita, visibilità delle strutture embrionali è essenziale e può essere ottenuto rimuovendo la membrana vitellina (A). Afferrare la membrana vitellina con finissima punta pinza e buccia delicatamente dalla dell&#39;embrione gestendo l&#39;embrione direttamente al bordo più esterno, se necessario(B). La rimozione della membrana vitellina aumenta la chiarezza delle strutture embrionali, e permette di embrioni di essere ripreso o trattati con ibridazione in situ (C). Barre di scala rappresentano 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51596/51596fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig3highres.jpg" /> Figura 3. Intero monte ibridazione in situ eseguita su zebra embrioni fringuello evolutivamente esposti al metilmercurio. Pattern di espressione di orthodenticle homeobox 2 (Otx2) sono stati caratterizzati negli embrioni esposti a 0,0 ppm metilmercurio (A, A &#39;) e 2,4 ppm metilmercurio (B, B &#39;) attraverso la dieta dei genitori. Il doRSAL (A) e ventrale (A &#39;) espressione di Otx2 è visibile durante le vescicole mesencefalo e ottiche durante la fase 12 22. Gli embrioni gruppo di trattamento sono stati sezionati nello stesso punto temporale, ma sono stati un ritardo dello sviluppo come visto nella dorsale (B) e ventrale (B &#39;) vista delle strutture della testa, che sono caratteristici della fase 11 22 Abbreviazioni:. mb, mesencefalo; op, vescicola ottica. Barre di scala rappresentano 1 mm. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig4highres.jpg" /> Figura 4. Whole mount &#160; in situ &#160; ibridazione eseguita su embrioni Zebra Finch evolutivamente esposti al metilmercurio. pattern di espressione di orthodenticle homeobox 2 (Otx2) sono stati caratterizzati in fase 6 22 Embry<html> os esposti a 0,0 ppm metilmercurio (A, A &#39;) e la fase 5 di 22 embrioni esposti a 2,4 ppm metilmercurio (B, B&#39;) attraverso la dieta dei genitori. Abbreviazioni: am, margine anteriore del mesoderma; no, notocorda, mesoderma notocorda; po, proamnion, blastopore anteriore; ps, stria primitiva 22. Barre di scala rappresentano 1 mm. <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig5highres.jpg" width="600" /> Montaggio Figura 5. Totale in situ &#160; ibridazione eseguita su zebra embrioni fringuello utilizzando la sonda senso. (A) Fase 5 22 embrioni. (B) Fase iniziale 6 22 embrioni. (C) Fase 11 22 embrioni. Barre di scala rappresentano 1 mm. 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51596/51596fig6highres.jpg &quot;/&gt; Figura 6. EdU costitutivo e di protezione in zebra embrioni fringuelli. EdU &quot;click&quot; chimica è stata utilizzata per rilevare le cellule proliferanti in una fase embrionale 16 22 (A, B, C). EdU viene incorporato nel DNA al posto della timidina 26, 27 e viene rilevato utilizzando click chemistry 27. Proliferazione è chiaramente visibile nei bordi laterali dei somiti e la tailbud. Pannello A mostra proliferazione presente esclusivamente nella parte posteriore dell&#39;embrione e mostra anche le cellule proliferative individuali. Pannello B mostra le posizioni proliferative in tutta embrione. Pannello C mostra la regione anteriore e mostra telencefalo altamente proliferativo (TE) con maggiori dettagli. Abbreviazioni: af, piega amniotico; FLB, zampa anteriore gemma; HLB, arti posteriori germoglio; le, obiettivo vescicola; ms, mesencefalo; mt, Metencephalon; opc, coppa ottica; pa, arco faringeo; sm, mesoderma somite; tb, tailbud; TE, telencefalo. Barre di scala rappresentano 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51596/51596fig6large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig7highres.jpg" /> Figura 7. Qualità di RNA estratto da embrioni sezionati Zebra Finch. Controllo (0,0 ppm) e 1,2 ppm embrioni metilmercurio sono stati sezionati e flash congelati come descritto al punto 3.8. Ogni corsia mostra RNA estratto da due embrioni omogeneizzati da ciascun gruppo di trattamento.

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Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications.

Dissezione e analisi valle di Zebra Finch embrioni nelle fasi iniziali dello sviluppo

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) has become an increasingly important model organism in many areas of research including toxicology1,2, behavior3, and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.8K Views.  College of William and Mary. The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications. 

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Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Dissezione di 6,5 embrioni di topo dpc

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

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Biologia

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Preparazione delle Culture neuronale da Midgastrula fase embrioni di Drosophila

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

Posizionamento Growth Factor-Coated Perline su embrioni di pollo Stadio

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Metodo per la Cultura di Chick primi embrioni ex vivo (Nuova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppia Monte intero ibridazione in situ di embrioni di pollo primi

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Isolamento efficiente e rapida di embrioni nelle prime fasi di<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semi

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Un protocollo per lentivirali trasduzione e analisi valle di intestinale organoidi

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis come un modello per individuare Traduzione Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune system &#8212; such as neutrophils, dendritic cells, and macrophages &#8212; retain the innate ability to detect and clear such invading pathogens through phagocytosis1. Phagocytosis involves choreographed events of membrane reorganization and actin remodeling at the cell surface2,3. Phagocytes successfully internalize and eradicate foreign molecules only when all stages of phagocytosis are fulfilled. These steps include recognition and binding of the pathogen by pattern recognition receptors (PRRs) residing at the cell surface, formation of phagocytic cup through actin-enriched membranous protrusions (pseudopods) to surround the particulate, and scission of the phagosome followed by phagolysosome maturation that results in the killing of the pathogen3,4.
Imaging and quantification of various stages of phagocytosis is instrumental for elucidating the molecular mechanisms of this cellular process. The present manuscript reports methods to study the different phases of phagocytosis. We describe a microscope-based approach to visualize and quantify the binding, phagocytic cup formation, and the internalization of particulate by phagocytes. As phagocytosis occurs when innate receptors on phagocytic cells encounter ligands on a target particle bigger than 0.5 &#181;m, the assays we present here comprise the use of pathogenic fungi Candida albicans and other particulates such as zymosan and IgG-coated beads.

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 &#181;m including zymosan and IgG-coated beads.

Visualizzare le fasi iniziali della fagocitosi

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...