Эта работа была поддержана финансирование в RAW из следующих: Национальные институты здоровья предоставляет K01 DK083512, DP2 OD008470 и R01 DK100237; Марш Dimes Василий О&#39;Коннор Стартер Scholar гранта # 5-FY12-75; запуска средства из Университета Нотр-Дам колледж науки и Отделения биологических наук; и щедрый подарок в Университет Нотр-Дам от Элизабет и Майкл Галлахер от имени Галлахер семьи, чтобы способствовать исследования стволовых клеток. Доноры не было роль в разработке исследования, сбор и анализ данных, решение о публикации или подготовки рукописи. Мы благодарим штабы Отделения биологических наук за их поддержку, и Центр данио рерио исследований в Нотр-Дам за их выдающуюся самоотверженность в помощи и благосостояния нашей данио колонии. Наконец, мы благодарим членов нашей исследовательской лаборатории для их комментарии, обсуждения и идеи по этой работе.

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Здесь мы описали методы, которые позволяют визуализировать компонентов сегмента нефрона в взрослых данио. Инъекция люминесцентных декстрана конъюгатов позволяет преимущественное маркировку РСТ должное эндоцитотического свойств этих клетках проксимальных канальцев 30,38. Этот метод может быть выполнена с большой гибкостью в связи с существованием декстраны, которые могут быть получены с собранием различных флуоресцентных конъюгатов. Кроме того, использование лизина-декстраны фиксации является особенно удобным способом для обозначения сегментов РСТ, как вторичные процедуры маркировки не требуется. Это позволяет достаточно простой обнаружение сигнала и совместим со многими другими флуоресцентных меток, иммунноокрашивания и использования трансгенных репортеров линий. Щелочная маркировка фосфатазы также отмечает проксимальных канальцах, с сильным реактивности в РСТ и несколько слабее реактивности в PST. Наконец, окрашивание DBA позволяет маркировку дистальных отделах канальцев, которые отображают СНaracteristic разветвленной морфологию. Различные молекулы лектина, которые сахара-связывающие белки из неиммунной происхождения, широко используются, чтобы отличить нефрона млекопитающих сегментов 47. Интересно, что DBA в данио коррелирует с дистальных отделах канальцев, как она используется, чтобы отметить собирательных трубочек в почках млекопитающих 47. Взятые вместе, эти методы могут быть использованы в различных комбинациях, чтобы документировать почечной состав и функцию. Поскольку все эти методы могут быть использованы в целых препаратов в почках, они обеспечивают инструменты для оценки структуры нефрона и функции на всей территории органа без полностью полагаться на использование более трудоемкий, утомительных методов, например, cryosection работы и иммунноокрашивания. Тем не менее, пятна, описанные в этой статье методы являются жизнеспособными в cryosection. Анализ Cryosection генерирует образцы (по сравнению с целой горе), которые лучше подходят для иммуногистохимии для определения специфических peptiде, хотя, конечно, этот тип анализа требует наличия соответствующих первичных антител. К сожалению, одна из основных ограничений в работе с данио животной модели остается бедным наличие антител. Таким образом WISH остается наиболее широко используется, т.е., &quot;идти к&quot; Процедура анализа экспрессии генов. ЖЕЛАЕМ помощью реакции субстрата BCIP, НБТ, и / или INT производить пурпурный или красный осадок не совместим с флуоресцентной окраски на криосрезов. Одним из вариантов было бы ссылаться на использование флуоресцентной детекции WISH, процедуры, который был оптимизирован для рыбок данио эмбриональных образцов и может быть адаптирована для использования с взрослого почки. Описание методов в этом видео статьи должны позволить для дальнейшего экспериментирования с методами, как флуоресцентного WISH в сочетании с трансгенных данио строк, в которых отдельные сегменты помечены с репортером например, EGFP или mCherry. С другой стороны, способы, описанные здесь, КоулаD испытываться в сочетании с другими жизненно важными красителей, например, других лектинов. Таким образом, дальнейшая адаптация и расширение методов, описанных здесь можно ссылаться в соответствии с потребностями исследователя для целых препаратов и анализа почек монтирования. Как таковые, эти методы имеют широкий потенциал для реализации с данио модели для текущих исследований регенерации, а также в моделировании генетического заболевания. Существует настоятельная потребность в инновационных исследований и методов лечения почечных недугов. Миллионы людей страдают от той или иной форме заболевания почек каждый год, что является результатом врожденных, острых и / или хронических причин. Кроме того, распространенность заболевания почек продолжает расти во всем мире, что делает эти заболевания глобальная проблема общественного здравоохранения 14,15. Процедуры, такие как гемодиализ доступны посредством внешнего диализа служит избавить кровь пациента метаболического отходов, если их почки не в состоянии выполнить эту роль. К сожалению, Это вмешательство имеет ограничения, как текущее лечение необходимо для выживания. Кроме того, пациенты в конечном итоге потребует пересадки почки, что может занять годы, чтобы получить один раз пациент помещается на листе ожидания. Даже после получения трансплантата почки, многие пациенты страдают неблагоприятных последствий в результате процедуры и должны бороться эти эффекты для остальной части их жизни. Эти трудности продемонстрировать серьезный необходимость разработки новых методов лечения либо помочь предотвратить болезни почек или, возможно, увеличить регенерацию тканей 8,16,52,53. Учитывая очевидные этические ограничения использования испытуемых человека в биомедицинских лабораториях, животные модели имеют важное значение для изучения патогенеза заболеваний человека и для тестирования новых методов лечения. В результате его анатомического сходства и эволюционной близости, мышь стала самой широко используемой моделью человеческого заболевания 45. Тем не менее, есть определенные ограничения с этим животным, ВКЛЮЧАЕТчисле неспособность визуализировать развитие органов в живом организме и практичности завершения масштабных генетических экраны. Данио рерио являются актуальными и полезными модельным организмом для изучения развития органов и моделирования болезней человека 45,46. В отношении болезней человека, функциональные гомологи у рыбок данио существует почти 70% всех генов человека 54,55. Недавняя работа подчеркнули полезность данио для многих областей научных исследований почек 31,37,56. Исследования регенерации и ремонта у рыбок данио после AKI предположить, что регенерация трубочка эпителиальных и neonephrogenesis два процесса, которые происходят и перекрываются по всей регенерации timecourse 30,37. Использование аминогликозидный антибиотиков под названием гентамицин была использована в качестве травмы парадигмы, через которую можно изучать результаты AKI во взрослой данио 29,30,37. Над примерно двухнедельного периода после получения травмы от гентамицин, ближний TUBULэс регенерировать, а тем временем новые нефронов образуют по всей органа 29,30,37. В целом механизмы, которые регулируют регенерации эпителия остаются весьма спорным. В одном предлагаемом механизме процесса ремонта, есть исходное событие острое повреждение с последующим отторжением мертвых клеток в просвет. Далее, существует ряд де-дифференциации, пролиферации и миграции событий, после чего новые клетки дифференцироваться, репопулирующих травмированного базальную мембрану и восстановления функции потерпевшей сайте. Кроме того, другие исследования показали, что запасные клетки возникают из стволовых клеток / клеток-предшественников, которые находятся в пределах нефрона канальцев. Что касается процесса neonephrogenesis у рыбок данио, сотовые заполнители наблюдались следующий AKI на гентамицин инъекции 29,30. Эти агрегаты позже созревают в новых нефронов, что отвес в уже существующие канальцев 29,30. Общая нить, которая объединяет нефроне регенерацию эпителия и neonephrogenesis является их явная фактором тайна: в настоящее время существует экспоненциально больше вопросов о том, как эти регенеративные подвиги происходят, чем есть в наличии идеи. На сегодняшний день, однако, несколько захватывающих линий доказательств поддерживают идею о том, что исследования почек регенерации с помощью данио может действительно обеспечить соответствующие сравнительные понимание человеческой AKI, что может также иметь прямое поступательное потенциальную 56-58. Химический анализ, чтобы определить малые молекулы, которые увеличивают пролиферацию почечных клеток-предшественников в эмбрионов рыбок данио недавно привело к идентификации деацетилаза ингибитор гистонов метил-4-(фенилтио) бутаноата (m4PTB) 56,57. Введение этого соединения к данио личинки с гентамицином-индуцированной ОПН показало, что выживаемость личинок увеличивается, и почечных канальцев, которые пролиферации была увеличена 56,58. Когда мыши с умеренной ишемией AKI лечили m4PTB, их восстановление было ускорено в доцтельная со снижением как трубчатой ​​атрофии и клеточного цикла ареста пролиферирующих клетках почечных канальцев 58. Эти данные позволяют предположить, что проводники, отвечающие за нормальное данио почечной развития и / или регенеративного ответ на AKI будет сохраняться с млекопитающих 56. Таким образом, в то время как необходимы дальнейшие исследования, чтобы дразнить друг от друга механизмы регенерации, а именно определить сигнальные пути, которые участвуют и понять их взаимодействия-данио предоставляет Одним из перспективных путей для достижения этой важной цели в области нефрологии. Такие инструменты, как нефрона клеточных меток, описанных в этом протоколе представляют одну группу анализов, которые могут быть использованы для оценки почечной состав и функциональность в модели Аки. Кроме того, они могут быть применены для характеристики трансгенных моделей заболеваний почек, и может обеспечить способы идентификации химических терапевтических средств, способных способствуя восстановлению структуры нефрона почек после плотинывозраст.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="754">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made by diluting 10 X Pbs in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbst</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbs with 0.05 % Tween</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.05% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB02038</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20&#176;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:99px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-1050</td>
			<td style="width:321px;">Dumont Tweezers Pattern #55&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Slide</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4445</td>
			<td style="width:321px;">White Frost&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Coverslip</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-540A</td>
			<td style="width:321px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Modeling Clay</td>
			<td style="width:99px;">Hasbro</td>
			<td style="width:119px;">Playdoh</td>
			<td style="width:321px;">Other modeling clays can be substituted and work similarly</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide Holder</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-587</td>
			<td style="width:321px;">Optional: cardboard tray to store slides flat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">Bleaching solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Bleach Mix Formula (for a 20 mL solution): 
			1.6 mL of 10% Potassium hydroxide solution 
			0.6 mL of 30% Hydrogen peroxide solution 
			100 &#956;l of 20% Tween 
			Fill to 20 mL with distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">221473</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H1009</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Blocking Solution (for a 10 mL solution): 
			8 mL of 1X Pbs with 0.05% Tween 
			2 mL of fetal calf serum 
			150 &#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Alkaline phosphatase activity detection</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td style="width:321px;">We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.&#160; To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Alkaline phosphatase wash solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 mL solution): 
			5 mL of 0.5M EDTA 
			120 mg of Levamisole 
			95 mL of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, fluorescein, 40,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1844</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, cascade blue, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1976</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1825</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1817</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">RL-10-32</td>
			<td style="width:321px;">DBA Staining Solution (for a 100 &#956;l solution): 
			1 &#956;l of DBA 
			99 &#956;l of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propidium iodide</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectashield Hard Set Mounting Medium</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1400</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro cover glass</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:119px;">48393081</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dimethyl Sulfoxide, DMSO</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">67-68-5</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0289</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EDTA, 0.5M Solution, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00502</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levamisole</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L-9756</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td style="width:99px;">Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TFM-C</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10x10x5mm</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4565</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TruBond 380 Adhesive Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Tru Scientific</td>
			<td style="width:119px;">0380W</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Liquid Blocker &#8211; Super PAP Pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71312</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Immuno stain moisture chamber</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>240-9020-Z10&#160;</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:99px;">Therm</td>
			<td style="width:119px;">Microm&#8482; HM 525 Cryostat</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows:&#160; Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Compound microscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney

Данио модель стала соответствующей системы для изучения развития почек, регенерации и болезни. Оба эмбриональные и взрослые данио почки состоят из функциональных блоков, известных как нефронов, которые высоко консервативных с других позвоночных, включая млекопитающих. Исследования на рыбках данио недавно показали, что два отличительных явления происходить после взрослых нефроны понести ущерб: во-первых, существует прочная регенерации в рамках существующих нефронов, что заменяет разрушенные канальцев эпителиальные клетки; Второй, совершенно новые нефроны изготавливаются из почечных клеток-предшественников в процессе, известном как neonephrogenesis. В отличие от этого, человека и других млекопитающих, похоже, только ограниченную способность к регенерации эпителия нефрона. На сегодняшний день, механизмы, ответственные за эти явления регенерации почки остаются плохо изучены. Поскольку взрослые данио почки пройти как нефроне регенерацию эпителия и neonephrogenesis, они обеспечивают выдающуюся экспериментальный пунктДигм изучать эти события. Кроме того, существует широкий спектр генетических и фармакологических средств, доступных в данио модели, которые могут быть использованы, чтобы очертить клеточные и молекулярные механизмы, которые регулируют почечной регенерации. Один из важнейших аспектов такого исследования является оценка структуры нефрона и функции. Этот протокол описывает набор методов маркировки, которые могут быть использованы для оценки почечной состав и функциональность тест нефроне в взрослых данио почки. Таким образом, эти методы широко применяются для будущего фенотипической характеристики взрослых данио парадигм повреждение почек, которые включают, но не ограничиваются ими, nephrotoxicant режимов воздействия или генетических методов направленного гибели клеток, таких как нитроредуктаза опосредованной клеточной техники абляции. Кроме того, эти методы могут быть использованы для изучения генетических возмущения в формировании почек взрослого, а также может применяться для оценки почечной статус при моделировании хронической болезни.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney at JoVE.com

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Данио взрослых почки является отличной системой для почечных регенерации и болезненных исследований. Важным аспектом таких исследований является оценка структуры нефрона и функции. Этот протокол описывает несколько методик, которые могут быть реализованы для оценки нефрона канальцев состав и оценить почечную реабсорбцию.

Анализ нефрона Состав и функции в почках взрослых данио рерио

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

analysis-nephron-composition-function-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

43.7K Views.  University of Notre Dame.  Данио взрослых почки является отличной системой для почечных регенерации и болезненных исследований. Важным аспектом таких исследований является оценка структуры нефрона и функции. Этот протокол описывает несколько методик, которые могут быть реализованы...

Video: Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Трансплантация почки Всего мозга у взрослых данио рерио

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Препарирование органов у взрослых данио рерио

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Внутрибрюшинного введения в взрослых данио рерио

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Трансплантация клеток непосредственно в почках взрослых данио рерио

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Препарирование взрослых почек данио рерио

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

В естественных условиях электропорации Morpholinos в Retina взрослых данио рерио

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

В естественных условиях электропорации Morpholinos в Восстанавливающий взрослых данио рерио хвостового плавника

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of molecular events and therapeutic strategies as well as for evaluating the physiological mechanisms of some pathologies1. 
There are relatively few publications related to adult zebrafish physiology of organs and systems2, which may lead researchers to infer that the basic techniques needed to allow the exploration of zebrafish systems are lacking3. Hematologic biochemical values of zebrafish were first reported in 2003 by Murtha and colleagues4 who employed a blood collection technique first described by Jagadeeswaran and colleagues in 1999. Briefly, blood was collected via a micropipette tip through a lateral incision, approximately 0.3 cm in length, in the region of the dorsal aorta5. Because of the minute dimensions involved, this is a high-precision technique requiring a highly skilled practitioner. The same technique was used by the same group in another publication in that same year6. In 2010, Eames and colleagues assessed whole blood glucose levels in zebrafish7. They gained access to the blood by performing decapitations with scissors and then inserting a heparinized microcapillary collection tube into the pectoral articulation. They mention difficulties with hemolysis that were solved with an appropriate storage temperature based on the work Kilpatrick et al.8. When attempting to use Jagadeeswaran's technique in our laboratory, we found that it was difficult to make the incision in precisely the right place as not to allow a significant amount of blood to be lost before collection could be started. 
Recently, Gupta et al.9 described how to dissect adult zebrafish organs, Kinkle et al.10 described how to perform intraperitoneal injections, and Pugach et al.11 described how to perform retro-orbital injections. However, more work is needed to more fully explore basic techniques for research in zebrafish.
The small size of zebrafish presents challenges for researchers using it as an experimental model. Furthermore, given this smallness of scale, it is important that simple techniques are developed to enable researchers to explore the advantages of the zebrafish model.

This paper presents a technique for collection of blood from the dorsal aorta of Zebrafish. It also provides instructions for obtaining serum for use in biochemical analyses, such as tests for determining cholesterol and triglyceride levels.

Забор крови для биохимического анализа у взрослых данио рерио

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging взрослых данио рерио

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Оценка данио рерио функции почек с помощью флуоресцентного Зазор Пробирной

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...