Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento a RAW dal seguente: National Institutes of Health concede K01 DK083512, DP2 OD008470, e R01 DK100237; March of Dimes Basil O&#39;Connor Starter Scholar concessione di una sovvenzione # 5-FY12-75; avviare i fondi presso l&#39;Università di Notre Dame College of Science e del Dipartimento di Scienze Biologiche; e un generoso dono per l&#39;Università di Notre Dame da Elizabeth e Michael Gallagher, a nome della famiglia Gallagher per promuovere la ricerca sulle cellule staminali. I finanziatori hanno avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta di dati e l&#39;analisi, decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto. Ringraziamo il personale del Dipartimento di Scienze Biologiche per il loro sostegno, e il Centro per la Ricerca Zebrafish a Notre Dame per la loro straordinaria dedizione nella cura e il benessere della nostra colonia zebrafish. Infine, ringraziamo i membri del nostro laboratorio di ricerca per i loro commenti, discussioni e approfondimenti su questo lavoro.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, abbiamo descritto i metodi che consentono la visualizzazione dei componenti segmento nefrone in zebrafish adulto. L&#39;iniezione di destrano coniugati fluorescenti consente etichettatura PCT preferenziale a causa delle proprietà endocitiche di queste cellule del tubulo prossimale 30,38. Questo metodo può essere eseguito con grande flessibilità dovuta all&#39;esistenza di destrani che può essere ottenuta con uno stuolo di diversi coniugati fluorescenti. Inoltre, l&#39;uso di destrani lisina-fissabile è un modo particolarmente conveniente per etichettare PCT segmenti, in quanto non sono necessarie procedure di etichettatura secondari. Ciò consente il rilevamento del segnale relativamente semplice ed è compatibile con molte altre etichette fluorescenti, immunomarcatura, e l&#39;uso di linee transgeniche giornalista. Etichettatura fosfatasi alcalina segna anche il tubulo prossimale, con una forte reattività in PCT e leggermente più debole reattività nel PST. Infine, la colorazione DBA consente l&#39;etichettatura dei segmenti tubulari distali, che mostrano una characteristic ramificata morfologia. Diverse molecole lectine, che sono proteine ​​di zucchero vincolanti di origine non immune, sono stati ampiamente utilizzati per distinguere i segmenti del nefrone mammiferi 47. E &#39;interessante che DBA in zebrafish correla con segmenti dei tubuli distali, in quanto è utilizzato per contrassegnare dotti collettori dei reni in mammiferi 47. Presi insieme, questi metodi possono essere utilizzati in varie combinazioni per documentare la composizione e la funzione renale. Poiché tutti questi metodi possono essere utilizzati in preparazioni renali interi, forniscono strumenti per valutare la struttura e la funzione del nefrone tutto l&#39;organo, senza dipendere interamente da l&#39;uso di più in termini di tempo, i metodi noiosi, ad esempio, il lavoro cryosection e immunomarcatura. Tuttavia, le macchie descritti in questo articolo metodi sono vitali in cryosection. Analisi Cryosection genera campioni (rispetto a tutto mount) che sono più adatti per immunoistochimica per rilevare Pepti specificides, anche se naturalmente questo tipo di analisi richiede la disponibilità di anticorpi primari appropriati. Purtroppo una limitazione importante nel lavoro con il modello animale di zebrafish rimane la scarsa disponibilità di anticorpi. Così WISH rimane il più largamente usato, cioè, &#39;go-to,&#39; procedura per l&#39;analisi di espressione genica. WISH utilizzando reazioni substrato BCIP, NBT, e / o INT per produrre precipitati viola o rosse non è compatibile con colorazione fluorescente su criosezioni. Una possibilità sarebbe quella di invocare l&#39;uso della rilevazione WISH fluorescente, una procedura che è stata ottimizzata per i campioni embrionali di zebrafish e potrebbe essere adattato per l&#39;uso con il rene adulto. La descrizione dei metodi in questo articolo il video dovrebbe consentire un&#39;ulteriore sperimentazione di tecniche come WISH fluorescente in combinazione con linee di zebrafish transgenici in cui i singoli segmenti vengono etichettati con un giornalista, come eGFP o mCherry. In alternativa, i metodi descritti qui could essere testato in combinazione con altri coloranti vitali, ad esempio, altre lectine. Così, ulteriore adattamento ed espansione dei metodi qui descritti potrebbero essere invocate per soddisfare le esigenze del ricercatore per interi preparati renali montaggio e analisi. Come tali, questi metodi hanno un potenziale ampio per l&#39;attuazione con il modello di zebrafish per gli studi di rigenerazione in corso e anche in modelli di malattia genetica. Vi è un urgente bisogno di ricerca innovativa e trattamenti per afflizioni renali. Milioni di persone soffrono di qualche forma di malattia renale ogni anno che deriva da cause congenite, acute e / o croniche. Inoltre, la prevalenza della malattia renale continua a crescere in tutto il mondo, rendendo queste malattie un problema di salute pubblica globale 14,15. Trattamenti come l&#39;emodialisi sono disponibili in base al quale una macchina di dialisi esterno serve per liberare il sangue di scorie metaboliche del paziente se i loro reni non sono in grado di svolgere questo ruolo. Sfortunatamente, Questo intervento ha dei limiti, come trattamento in corso è necessario per la sopravvivenza. Inoltre, i pazienti richiederebbero un trapianto di rene, che può richiedere anni per ricevere una volta che un paziente è posto su una lista d&#39;attesa. Anche dopo l&#39;ottenimento di un trapianto di rene, molti pazienti soffrono gli effetti negativi a seguito della procedura e devono combattere questi effetti per il resto della loro vita. Queste difficoltà dimostrano la grave necessità per lo sviluppo di nuovi trattamenti per aiutare a prevenire o malattie renali o forse per aumentare la rigenerazione dei tessuti 8,16,52,53. Date le ovvie limitazioni etiche dell&#39;uso di cavie umane nei laboratori biomedici, modelli animali sono essenziali per lo studio della patogenesi delle malattie umane e per la sperimentazione di nuovi trattamenti. Come risultato della sua somiglianza anatomica e la vicinanza evolutiva, il topo è diventato il modello più diffuso delle malattie umane 45. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni con questo animale, inclusa,ing incapacità di visualizzare lo sviluppo degli organi in vivo e la praticità di completare schermi genetici su larga scala. Zebrafish sono una rilevante e utile organismo modello per lo studio dello sviluppo degli organi e modellazione delle malattie umane 45,46. Per quanto riguarda la malattia umana, esistono omologhi funzionali in zebrafish per quasi il 70% di tutti i geni umani 54,55. Studi recenti hanno messo in evidenza l&#39;utilità di zebrafish per molti settori della ricerca 31,37,56 rene. Studi di rigenerazione e riparazione in zebrafish dopo AKI suggeriscono che la rigenerazione tubulo epiteliale e neonephrogenesis sono due processi che si verificano e si sovrappongono durante la rigenerazione timecourse 30,37. L&#39;uso di un aminoglicoside antibiotico chiamato gentamicina è stata utilizzata come un paradigma lesione attraverso cui studiare i risultati di AKI in zebrafish adulto 29,30,37. Su una di circa due settimane periodo successivo lesioni da gentamicina, la Tubul prossimalees rigenerano, e nel frattempo nuovi nefroni formano tutto l&#39;organo 29,30,37. In generale, i meccanismi che regolano la rigenerazione epiteliale rimangono molto controversa. In quello proposto meccanismo del processo di riparazione, vi è l&#39;evento lesione acuta iniziale seguita da una desquamazione delle cellule morte nel lume. Avanti, c&#39;è una serie di de-differenziazione, proliferazione, e gli eventi di migrazione, dopo che le nuove cellule si differenziano, ripopolare la membrana basale feriti e funzione di ripristino al sito danneggiato. In alternativa, altri studi hanno suggerito che le cellule di ricambio derivano da cellule staminali / progenitrici che risiedono all&#39;interno tubuli del nefrone. Per quanto riguarda il processo di neonephrogenesis in zebrafish, aggregati cellulari sono stati osservati seguente AKI per iniezione gentamicina 29,30. Questi aggregati successivamente maturano in nuovi nefroni che Plumb in tubuli già esistenti 29,30. Il filo comune che unisce la rigenerazione epiteliale nefrone e neonephrogenesis è il loro fattore mistero puro e semplice: al momento non vi sono esponenzialmente più domande su come queste gesta di rigenerazione in quanto ci sono approfondimenti disponibili. Ad oggi, tuttavia, diverse linee emozionanti prove supportano l&#39;idea che la ricerca di rigenerazione renale utilizzando zebrafish può infatti fornire importanti spunti comparativi in AKI umana che può anche avere diretto traslazionale potenziale 56-58. Lo screening chimico per identificare piccole molecole che aumentano la proliferazione delle cellule progenitrici renali nell&#39;embrione zebrafish recentemente portato all&#39;identificazione della -butanoate inibitore delle istone deacetilasi metil-4-(feniltio) (m4PTB) 56,57. La somministrazione di questo composto di larve di zebrafish con gentamicina indotta AKI ha rivelato che la sopravvivenza larvale aumentato e che la proliferazione renale tubulare è stata rafforzata 56,58. Quando i topi con moderata AKI ischemia-indotta sono stati trattati con m4PTB, il loro recupero è stato accelerato in association con una riduzione sia in tubolare di atrofia e arresto del ciclo cellulare delle cellule proliferanti tubulari renali 58. Questi risultati suggeriscono che le vie responsabili per il normale sviluppo zebrafish renale e / o la risposta rigenerativa di AKI saranno conservati con i mammiferi 56. Così, mentre sono necessari ulteriori studi per prendere in giro a parte i meccanismi di rigenerazione, cioè quello di individuare le vie di segnalazione che sono coinvolti e comprendere la loro interazione, il pesce zebra fornisce una strada promettente per perseguire questo importante obiettivo nel campo nefrologia. Strumenti come le etichette cellulari nefrone descritte in questo protocollo rappresenta un gruppo di saggi che possono essere utilizzati per valutare la composizione e la funzionalità renale in modelli di AKI. Inoltre, possono essere applicati per caratterizzare modelli transgenici di malattia renale e possono fornire modi per identificare terapie chimiche in grado di promuovere il ripristino della struttura del nefrone dopo la diga renaleetà.

Il rene è un organo complesso che svolge una moltitudine di funzioni fisiologiche del corpo. La funzione più importante del rene è metabolica escrezione dei rifiuti, e questo compito è strettamente intrecciata con il mantenimento dell&#39;omeostasi fluido. Il rene svolge questi posti di lavoro filtrando il sangue e la formazione di urine, mentre in concomitanza regolazione della pressione sanguigna, livelli di elettroliti e dell&#39;equilibrio acido-base. Tubuli altamente specializzati epiteliali chiamate nefroni servono come unità funzionale di base del rene 1,2. Nei vertebrati adulti, nefroni sono in genere organizzati in una disposizione strettamente avvolto intorno un sistema di drenaggio centralizzato, permettendo così per molti tubuli per il confezionamento in abbastanza piccolo organo. Ad esempio, ogni rene umano può contenere oltre 1 milione di nefroni 3. Altri mammiferi come il mouse possiedono su ordine di 8-10.000 nefroni al rene 4. Il grado di complessità renale differisce tra questi mammiferi e altri vertebrates dovute a variazioni nel numero totale nefrone e la loro disposizione architettonica all&#39;interno del rene. Specie di vertebrati formano ben tre strutture renali successivi durante lo sviluppo, ed ogni forma display crescente complessità per quanto riguarda nefrone dotazione e disposizione: le pronephros, mesonefro, e metanefro. L&#39;ultima struttura renale da conservare serve come il rene adulto organo-tipicamente un mesonefro o un metanefro 2. Ogni forma di rene, tuttavia, ha una composizione basata nefrone-2. Il nefrone è il cavallo di battaglia del rene ed è responsabile per la filtrazione del sangue insieme con la secrezione metabolita e riassorbimento. Nefroni sono semplici strutture tubolari composti da cellule epiteliali e hanno una organizzazione segmentale, in cui discreti, domini altamente specializzati di epiteli differenziati eseguire compiti specifici. In ordine di flusso filtrato attraverso il nefrone, ci sono in genere tre parti principali che comprise ogni unità: (1) il corpuscolo renale, (2) un tubulo prossimale con, intermedio, e segmenti distali, e (3) un condotto di raccolta 1. Il tubulo prossimale è responsabile del riassorbimento di soluti organici, più in particolare glucosio e aminoacidi 1. Il tubulo intermedio (o di Henle) è un importante sito di sale e acqua regolazione 1. Infine, la messa a punto di sale e di altri ioni avviene nel tubulo distale e dotto collettore ed è altamente regolato dal sistema endocrino 1. Da lì, il filtrato viaggia attraverso l&#39;uretere e vescica, in definitiva uscita dal corpo come prodotto di scarto 1. La perdita di funzione renale può derivare da una moltitudine di cause che impediscono la normale attività nefrone. Queste cause possono verificarsi durante lo sviluppo del rene, ad esempio, i difetti congeniti che portano alla malformazione di nefroni 5, o cause di diversi tipi di danni (derivanti sia da genetica e environmeorigini ntale). Lesioni acquisite sono ampiamente classificati come lesione acuta del rene (AKI) o danno renale cronica (CKD). AKI comporta una perdita improvvisa della funzione renale, spesso derivanti da ischemia o tossina esposizione 6,7. Nei mammiferi, la riparazione epiteliale nefrone è possibile dopo tali lesioni 8, e molte persone presentano pieno ripristino della funzione renale dopo AKI. Tuttavia, AKI è anche associata ad alta morbilità e mortalità che sono stati riportati in un ampio 30 - 70% Intervallo di incidenza 6,7. CKD, al contrario, è associata con perdita progressiva della funzione renale che deriva da anni di danni prolungato, tipicamente associata a fibrosi 8,9. Inoltre, esiste un&#39;interazione tra AKI e CKD, sia come si può predisporre un individuo all&#39;altro 10-12. Per esempio, coloro che hanno sofferto di AKI sono più suscettibili di CKD e anche la morte 13. L&#39;incidenza della malattia renale, sia negli Stati Uniti e nel mondo, ha raggiunto epideproporzioni microfono e si prevede un aumento come la popolazione di età compresa tra espande, quindi non vi è una crescente necessità di individuare interventi di medicina rigenerativa per il rene 14,15. Nonostante la consapevolezza che i pazienti AKI possono recuperare, è stato a lungo pensato che il rene è un organo senza innati poteri rigenerativi. Questo punto di vista tradizionale è stato notevolmente modificato negli ultimi anni 16. Gli studi che indagano danno renale nei topi e nei ratti dopo AKI hanno dimostrato che le cellule epiteliali del tubulo del nefrone possono proliferare e ricostruire nefroni funzionali 17-20. Anche se i mammiferi possiedono questa capacità di adattamento di rigenerare nefroni, ci sono notevoli limitazioni e le risposte disadattivi possono essere innescate che portano alla fibrosi renale e CKD 21. Ad esempio, un recente studio ha dimostrato che la ripetuta ablazione delle cellule epiteliali in nefroni murini è stato associato con rigenerazione diminuita e nefroni fibrosi renale suggerendo-HAVEA limitata soglia di rigenerazione 22. Non ci sono prove che l&#39;adulto rene mammiferi forma nuovi nefroni per sostituire quelli persi o danneggiati, così la loro distruzione porta ad un deficit permanente nefrone 8,9. È interessante notare che alcuni vertebrati rispondono a AKI rigenerando nefrone epiteli e producendo anche nuovi nefroni, un processo denominato neonephrogenesis o nefrone neogenesi 23. Neonephrogenesis avviene nei pesci dopo l&#39;esposizione ad una tossina o resezione parziale, e modelli di pregiudizio hanno storicamente incluso il pesce rosso 24,25, tilapia 26, pattino 27, Medaka 28, e, più recentemente, il pesce zebra 29,30. Di questi, zebrafish fornire un modello di ricerca genetica praticabile per scoprire le vie cellulari e molecolari responsabili della rigenerazione renale. In questo articolo il video, dimostriamo come etichettare i segmenti del nefrone in zebrafish adulto. Conoscenze di anatomia nefrone, caratteristiche molecolari,e caratteristiche funzionali sono essenziali per gli studi renali futuro di successo utilizzando zebrafish. Il rene zebrafish adulto è una struttura mesonefro ed è intrinsecamente meno complessa in termini di numero nefrone e di organizzazione che la struttura metanefro trovati in mammiferi adulti, avians, e rettili 31. Tuttavia, zebrafish organizzazione segmento nefrone è analogo ai mammiferi, ed è stata la prima volta nel rene embrionale sulla base di studi di espressione genica 31-35. Nefroni zebrafish contengono segmenti lineari tubulari che includono il tubulo contorto prossimale (PCT), tubulo prossimale dritto (PST), distale precoce (DE), e distale tardi (DL) 31-35 (Figura 1). Nefroni Zebrafish adulti in possesso di segmenti tubolari simili 30,31,36,37 (Figura 1). La PCT può essere identificato anche da un fenotipo funzionale: le cellule epiteliali del PCT incorporeranno composti destrano fluorescente (10-70 kDa dimensioni) presenti nelcircolazione, che è stato utilizzato sia nella zebrafish rene embrionale ed adulto per valutare l&#39;assorbimento endocitica da queste cellule del tubulo prossimale 38-41 (Figura 1). Una differenza nel nefrone tra zebrafish e mammiferi è che zebrafish mancano di un tubulo intermedio, o di Henle 30-37; dal momento che questo funzioni segmento nei mammiferi per conservare l&#39;acqua, e zebrafish sono una specie di acqua dolce, senza l&#39;urgenza di concentrare l&#39;urina, non è sorprendente che zebrafish manca questo segmento 32,33. Pertanto, la composizione complessiva nefrone è in gran parte conservata tra il pesce zebra e reni mammiferi 32,33. Queste somiglianze hanno permesso zebrafish ad essere uno strumento di ricerca efficace per studiare le funzioni dei geni-renale espressa nel corso nefrogenesi sviluppo 32-35,42 e modellare numerose malattie renali 43,44, aggiungendo così alla lista sostanziale di condizioni umane che possono essere indagato utilizzandozebrafish 45,46. Oggi, il rene zebrafish adulto è un modello attraente per gli studi comparativi di rigenerazione renale a causa della sua trattabilità genetica e il palato espansione delle risorse tecnologiche disponibili per interrogare la funzione del gene e vie di segnalazione in questa specie. Diversi studi hanno utilizzato i mesonefro zebrafish per studiare i meccanismi di rigenerazione dopo AKI 29,30,37. Per la continua ricerca AKI utilizzando il rene zebrafish adulto, è essenziale disporre di metodi squisiti per etichettare diverse regioni e metodi nefrone per esaminare la funzionalità nefrone. Diversi metodi di analisi rene adulto sono stati adattati dai protocolli renali embrionali. Iniezione intraperitoneale di destrano fluorescente etichettati in zebrafish adulto etichette l&#39;epitelio PCT in mesonefro nefroni via endocitosi 30, come in embrioni di zebrafish 38-41 (Figura 1). Questo metodo è stato utilizzato per visualize quando tubuli prossimali riacquistano le loro proprietà riassorbire seguente AKI, che consente una valutazione della funzione fisiologica restaurato 30 (Figura 1). Un&#39;altra caratteristica del nefrone tubulo prossimale è che le cellule epiteliali in questo segmento in possesso di un bordo spazzola 37 che mostra alti livelli di fosfatasi alcalina endogena. Così, l&#39;epitelio prossimale può essere localizzato visivamente nel rene adulto zebrafish utilizzando una tecnica a fluorescenza conosciuta come Elf (marcato con enzima Fluorescence) -97 47. Qui, descriviamo come eseguire fluorescenti test di assorbimento di destrano 30,48 nell&#39;adulto rene zebrafish, in modo da ottenere una valutazione funzionale del tubulo prossimale e mappare le dimensioni e contorni di questo segmento tubulo. Avanti, descriviamo le tecniche di etichettare le regioni del tubulo prossimale del nefrone adulto con la fosfatasi alcalina etichetta fluorescente. In terzo luogo, si mostra per la prima volta che la rhodammina tag lectina Dolichos biflorus agglutinina (DBA), che è stato utilizzato come marcatore generale dei collettori nel rene dei mammiferi 49, segna i tubuli distali del rene adulto zebrafish. Come DBA è mutuamente esclusivo di fosfatasi alcalina colorazione, queste etichette forniscono un modo per distinguere ampiamente pan-prossimale rispetto tratti pan-distali del nefrone zebrafish adulto. Durante l&#39;attuazione di tali macchie fluorescenti sia in tutto il monte e sezioni istologiche al criostato, mettiamo in relazione queste etichette con i domini di espressione di geni soluto trasportatore che identificano in modo univoco ciascun segmento nefrone. Quindi questo protocollo contiene anche una guida per le procedure di trattamento dei tessuti modificati per tessuti adulti montare tutto ibridazione in situ (WISH) analisi sulla base della nostra embrione protocollo WISH 50. Tali procedure possono essere utilizzate in varie combinazioni (Figura 2) per documentare caratteristiche morfologiche e funzionali of adulti nefroni renali zebrafish. Così, questi protocolli possono essere applicati a studi di rigenerazione, la caratterizzazione fenotipica di altri modelli di malattia renale, e anche usati per studiare la formazione del rene adulto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="754">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made by diluting 10 X Pbs in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbst</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbs with 0.05 % Tween</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.05% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB02038</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20&#176;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:99px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-1050</td>
			<td style="width:321px;">Dumont Tweezers Pattern #55&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Slide</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4445</td>
			<td style="width:321px;">White Frost&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Coverslip</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-540A</td>
			<td style="width:321px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Modeling Clay</td>
			<td style="width:99px;">Hasbro</td>
			<td style="width:119px;">Playdoh</td>
			<td style="width:321px;">Other modeling clays can be substituted and work similarly</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide Holder</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-587</td>
			<td style="width:321px;">Optional: cardboard tray to store slides flat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">Bleaching solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Bleach Mix Formula (for a 20 mL solution): 
			1.6 mL of 10% Potassium hydroxide solution 
			0.6 mL of 30% Hydrogen peroxide solution 
			100 &#956;l of 20% Tween 
			Fill to 20 mL with distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">221473</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H1009</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Blocking Solution (for a 10 mL solution): 
			8 mL of 1X Pbs with 0.05% Tween 
			2 mL of fetal calf serum 
			150 &#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Alkaline phosphatase activity detection</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td style="width:321px;">We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.&#160; To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Alkaline phosphatase wash solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 mL solution): 
			5 mL of 0.5M EDTA 
			120 mg of Levamisole 
			95 mL of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, fluorescein, 40,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1844</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, cascade blue, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1976</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1825</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1817</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">RL-10-32</td>
			<td style="width:321px;">DBA Staining Solution (for a 100 &#956;l solution): 
			1 &#956;l of DBA 
			99 &#956;l of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propidium iodide</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectashield Hard Set Mounting Medium</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1400</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro cover glass</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:119px;">48393081</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dimethyl Sulfoxide, DMSO</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">67-68-5</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0289</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EDTA, 0.5M Solution, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00502</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levamisole</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L-9756</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td style="width:99px;">Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TFM-C</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10x10x5mm</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4565</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TruBond 380 Adhesive Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Tru Scientific</td>
			<td style="width:119px;">0380W</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Liquid Blocker &#8211; Super PAP Pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71312</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Immuno stain moisture chamber</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>240-9020-Z10&#160;</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:99px;">Therm</td>
			<td style="width:119px;">Microm&#8482; HM 525 Cryostat</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows:&#160; Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Compound microscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney

Il modello di zebrafish è emerso come un sistema rilevante per studiare lo sviluppo del rene, la rigenerazione e la malattia. Entrambi i reni zebrafish embrionali e adulte sono composti da unità funzionali noti come nefroni, che sono altamente conservati con altri vertebrati, compresi i mammiferi. La ricerca in zebrafish ha recentemente dimostrato che due fenomeni distinti trasparire dopo nefroni adulti subiscono danni: in primo luogo, vi è la rigenerazione robusto all&#39;interno di nefroni esistenti che sostituisce le cellule epiteliali del tubulo distrutte; secondo, completamente nuovi nefroni sono prodotte da progenitori renali in un processo noto come neonephrogenesis. Al contrario, gli esseri umani e altri mammiferi sembrano avere solo una limitata capacità di rigenerazione epiteliale nefrone. Ad oggi, i meccanismi responsabili di questi fenomeni di rigenerazione del rene rimangono poco conosciute. Dal momento che i reni zebrafish adulti subiscono sia la rigenerazione epiteliale nefrone e neonephrogenesis, forniscono un eccezionale para sperimentaleparadigma per studiare questi eventi. Inoltre, vi è una vasta gamma di strumenti genetici e farmacologici disponibili nel modello zebrafish che possono essere utilizzati per delineare i meccanismi cellulari e molecolari che regolano la rigenerazione renale. Un aspetto essenziale di tale ricerca è la valutazione della struttura e funzione del nefrone. Questo protocollo descrive un insieme di tecniche di etichettatura che possono essere utilizzati per misurare la composizione e la funzionalità renale prova nefrone nel rene zebrafish adulto. Così, questi metodi sono ampiamente applicabili per il futuro caratterizzazione fenotipica di Zebrafish adulti paradigmi danno renale, che comprendono, ma non sono limitati a, i regimi di esposizione nephrotoxicant o metodi genetici di morte delle cellule bersaglio, quali il nitroreduttasi mediata tecnica di ablazione delle cellule. Inoltre, questi metodi potrebbero essere utilizzati per studiare perturbazioni genetiche in formazione rene adulto e potrebbero essere applicate anche per valutare lo stato renale durante la modellazione delle malattie croniche.

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Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Il rene adulto zebrafish è un sistema eccellente per gli studi di rigenerazione e malattie renali. Un aspetto essenziale di tale ricerca è la valutazione della struttura e funzione del nefrone. Questo protocollo descrive le diverse metodologie che possono essere implementate per valutare la composizione nefrone tubulo e per valutare il riassorbimento renale.

Analisi di Nefrone Composizione e funzione del rene Zebrafish adulti

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

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Research

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Biology

43.7K Views.  University of Notre Dame.  Il rene adulto zebrafish è un sistema eccellente per gli studi di rigenerazione e malattie renali. Un aspetto essenziale di tale ricerca è la valutazione della struttura e funzione del nefrone. Questo protocollo descrive le diverse metodologie che possono essere implementate per valutare la composizione nefrone tubulo e per valutare il riassorbimento renale. 