Name: analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney
Uploaded: 2014-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung von RAW aus der folgenden unterstützt: National Institutes of Health gewährt K01 DK083512, DP2 OD008470 und R01 DK100237; March of Dimes Basil O&#39;Connor Starter Scholar Finanzhilfe # 5-FY12-75; Start-up-Fonds von der University of Notre Dame College of Science und Department of Biological Sciences; und ein großzügiges Geschenk an die Universität von Notre Dame von Elizabeth und Michael Gallagher im Namen der Familie Gallagher zu fördern Stammzellforschung. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Vorbereitung des Manuskripts. Wir danken den Mitarbeiter der Abteilung für Biologische Wissenschaften für ihre Unterstützung, und das Zentrum für Forschung an Zebrafisch-Notre-Dame für ihre herausragenden Engagement in der Pflege und das Wohlergehen unserer Zebrafisch-Kolonie. Schließlich danken wir den Mitgliedern unserer Forschungslabor für ihre Kommentare, Diskussionen und Erkenntnisse über diese Arbeit.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier haben wir Methoden, die die Visualisierung von Nephron Segment Komponenten im erwachsenen Zebrafisch ermöglichen beschrieben. Die Injektion von fluoreszierenden Dextran-Konjugate ermöglicht Vorzugs PCT Kennzeichnung aufgrund der Eigenschaften dieser endozytischen proximalen Tubuluszellen 30,38. Dieses Verfahren kann sehr flexibel auf die Existenz von Dextranen, die mit einer Schar von unterschiedlichen Fluoreszenz-Konjugate erhalten werden können, durchgeführt werden. Darüber hinaus ist die Verwendung von Lysin fixierbar Dextrane eine besonders bequeme Weise, PCT Segmente kennzeichnen, als sekundäre Markierungsverfahren sind nicht erforderlich. Dies ermöglicht relativ einfache Signalerfassung und ist mit vielen anderen fluoreszierenden Markern, Immunmarkierung, und die Verwendung von transgenen Reporteranschlüsse. Alkalische Phosphatase Kennzeichnung markiert auch den proximalen Tubuli, mit starken Reaktivität in der PCT und etwas schwächer Reaktivität im PST. Schließlich ist die DBA-Färbung ermöglicht die Kennzeichnung von distalen Tubuli Segmente, die eine CH anzeigenaracteristic verzweigte Morphologie. Verschiedene Lektin-Moleküle, die Zucker-bindende Proteine ​​von nicht-immunen Ursprungs sind, wurden ausgiebig genutzt, um Säugetier Nephronsegmenten 47 unterscheiden. Es ist interessant, dass DBA im Zebrafisch korreliert mit distalen Tubuli Segmente, wie es verwendet wird, um Sammelkanäle in Säuger Nieren 47 zu kennzeichnen. Zusammengenommen können diese Methoden in verschiedenen Kombinationen verwendet werden, um die Nierenfunktion Zusammensetzung und zu dokumentieren. Da alle diese Verfahren können in ganzen Nieren Zubereitungen verwendet werden, bieten sie Werkzeuge Nephron Struktur und Funktion im gesamten Organ zu bewerten, ohne vollständig die sich auf die Verwendung von mehr zeitaufwendig, mühsam Verfahren, zB Kryoschnittes Arbeit und Immunmarkierung. Jedoch sind die in diesem Artikel beschriebene Verfahren Flecken tragfähige Kryoschnittes. Kryoschnitt Analyse erzeugt (im Vergleich zu ganze Berg), die besser geeignet für die Immunhistochemie auf spezifische Pepti erkennen sinddes, obwohl natürlich diese Art der Analyse erfordert die Verfügbarkeit von entsprechenden primären Antikörper. Leider eine große Einschränkung in der Arbeit mit dem Zebrafisch Tiermodell bleibt die schlechte Verfügbarkeit von Antikörpern. So bleibt der Wunsch der am weitesten verbreitete, dh &quot;go-to&quot; Verfahren zur Analyse der Genexpression. WÜNSCHEN mit BCIP, NBT, und / oder INT-Substrat-Reaktionen bis violett oder rot Niederschläge zu produzieren ist nicht mit Fluoreszenzfärbung auf Gefrierschnitten kompatibel. Eine Möglichkeit wäre die Verwendung von Fluoreszenzdetektion WISH, ein Verfahren, bei Zebrafisch embryonalen Proben optimiert wurde und könnte zur Verwendung mit der erwachsenen Niere zugeschnitten werden aufzurufen. Die Beschreibung der Methoden in diesem Video-Artikel sollte für weitere Experimente mit Techniken wie Fluoreszenz WISH in Kombination mit transgenen Zebrafischlinien, in denen einzelnen Segmente werden mit einem Reporter, wie eGFP oder mCherry markierten ermöglichen. Alternativ die hier beschriebenen Methoden could in Kombination mit anderen Vitalfarbstoffe, zB andere Lektine getestet werden. So könnte eine weitere Anpassung und Erweiterung der hier beschriebenen Methoden aufgerufen werden, um die Bedürfnisse der Forscher für ganze Berg Nierenpräparate und Analyse gerecht zu werden. Als solche haben diese Methoden breite Potenzial für die Umsetzung mit dem Zebrafisch-Modell für die laufende Regeneration Studien und auch in der genetischen Krankheit Modellierung. Es besteht ein dringender Bedarf für innovative Forschung und Behandlungen für Nieren Beschwerden. Millionen von Menschen leiden an irgendeiner Form von Nierenerkrankungen pro Jahr, die von angeborenen, akute und / oder chronische Ursachen führt. Ferner ist die Prävalenz von Nierenerkrankungen weiterhin weltweit steigen, was diese Krankheiten ein globales Problem der öffentlichen Gesundheit 14,15. Behandlungen, wie Hämodialyse sind, wodurch eine externe Dialysegerät dient, Blut von Stoffwechsel eines Patienten zu befreien, wenn die Nieren nicht in der Lage, diese Aufgabe durchzuführen. Leider, Hat dieser Eingriff Einschränkungen, die laufende Behandlung für das Überleben notwendig ist. Darüber hinaus werden Patienten schließlich erfordern eine Nierentransplantation, die Jahre in Anspruch nehmen können, um zu erhalten, sobald ein Patient auf eine Warteliste gesetzt. Selbst nach Erhalt einer Nierentransplantation, leiden viele Patienten Nebenwirkungen als Folge des Verfahrens und muß diese Effekte für den Rest ihres Lebens zu kämpfen. Diese Schwierigkeiten zeigen, die schwere Notwendigkeit für die Entwicklung von neuartigen Behandlungen, um entweder zu verhindern, Nierenerkrankungen oder vielleicht ergänzen Geweberegeneration 8,16,52,53. Angesichts der offensichtlichen ethischen Einschränkungen der Verwendung von menschlichen Probanden in biomedizinischen Laboratorien sind Tiermodelle wichtig für die Untersuchung der menschlichen Krankheitsentstehung und zum Testen von neuen Therapien. Als Ergebnis ihrer anatomischen Ähnlichkeit und evolutionäre Nähe hat der Maus werden die am häufigsten verwendete Modell der menschlichen Krankheit 45. Es gibt jedoch gewisse Beschränkungen für dieses Tier, including Unfähigkeit Organentwicklung in vivo und Praktikabilität der Vollendung großen genetischen Screens zu visualisieren. Zebrafische sind eine wichtige und nützliche Modellorganismus zur Untersuchung der Organentwicklung und Modellierung der menschlichen Krankheit 45,46. In Bezug auf die menschliche Krankheit, funktionale Homologen im Zebrafisch gibt es für fast 70% aller menschlichen Gene 54,55. Neuere Arbeiten haben den Nutzen der Zebrafisch für viele Bereiche der Nierenforschung 31,37,56 hervorgehoben. Studium der Regeneration und Reparatur im Zebrafisch nach AKI legen nahe, dass Röhrchen epithelialen Regeneration und neonephrogenesis sind zwei Prozesse, die auftreten und überlappen in der gesamten Regenerationszeitverlauf 30,37. Die Verwendung von einem Aminoglykosid-Antibiotikum Gentamicin genannt wurde als Schadens Paradigma, durch die die Ergebnisse des AKI bei erwachsenen Zebrafisch 29,30,37 studieren eingesetzt. Über einen etwa zwei Wochen nach der Verletzung von Gentamicin, der proximale Tubules regenerieren, und in der Zwischenzeit neue Nephrone bilden in der gesamten Orgel 29,30,37. Im Allgemeinen sind die Mechanismen, die Epithelregeneration regulieren weiterhin sehr umstritten. Bei einem vorgeschlagenen Mechanismus des Reparaturprozesses, da die anfängliche akute Verletzungsanlaß gefolgt von einer Ablösung von toten Zellen in das Lumen. Weiter gibt es eine Reihe von de-Differenzierung, Proliferation und Migration Ereignisse, nach denen neue Zellen zu differenzieren, repopulating den verletzten Basalmembran und Wiederherstellung der Funktion zu der verletzten Stelle. Alternativ können andere Studien haben vorgeschlagen, dass der Ersatz-Zellen von Stammzellen / Vorläuferzellen, die in Nephron Tubuli liegen kommen. Im Hinblick auf den Prozess der neonephrogenesis im Zebrafisch, haben Zellaggregaten wurde von Gentamicin Injektion 29,30 beobachtet folgende AKI. Diese Aggregate später reifen in neuen Nephrone, die in bereits bestehende Tubuli 29,30 auszuloten. Der rote Faden, der nephron epithelialen Regeneration und neonephr vereintogenesis ist ihre schiere Geheimnis Faktor: derzeit gibt es mehr Fragen exponentiell zu, wie diese regenerativen Leistungen auftreten, als es verfügbar Einsichten. Bis heute ist jedoch, mehrere spannende Beweislinien unterstützen die Vorstellung, dass die Nierenregeneration Forschung mit Zebrafisch kann in der Tat relevante Vergleichs Einblicke in die menschliche AKI, die auch haben können direkte translationale Potenzial 56-58. Chemisches Screening nach kleinen Molekülen, die die Proliferation von Nierenvorläuferzellen im Zebrafischembryo kürzlich zur Identifizierung der Histon-Deacetylase-Inhibitor Methyl-4-(phenylthio) -butanoate (m4PTB) 56,57 geführt erhöhen identifizieren. Verabreichung dieser Verbindung zu Zebrafisch-Larven mit Gentamicin-induzierte AKI ergab, dass Überlebens von Larven erhöht und dass die renale tubuläre Proliferation wurde verbessert 56,58. Wenn Mäuse mit moderaten Ischämie-induzierten AKI wurden mit m4PTB behandelt, ihre Erholung beschleunigt association mit einer Reduktion sowohl tubuläre Atrophie und Zellzyklusarrest proliferierender Nierenröhrenzellen 58. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Wege für die normalen Zebrafisch Nierenentwicklung und / oder die regenerative Reaktion auf AKI verantwortlich ist, wird mit 56 Säugetieren konserviert werden. So, während weitere Studien erforderlich sind, um necken neben die Mechanismen der Regeneration, nämlich um die Signalwege, die beteiligt sind, zu identifizieren und zu verstehen, ihre Wechselwirkungen der Zebrafisch-bietet ein vielversprechender Weg, um dieses wichtige Ziel in der Nephrologie Feld zu verfolgen. Werkzeuge wie die in diesem Protokoll beschrieben Nephron Zelle Etiketten stellen eine Gruppe von Assays, die verwendet werden können, Nieren Zusammensetzung und Funktionalität AKI Modelle zu evaluieren. Ferner können sie verwendet, um transgene Modelle von Nierenerkrankungen zu charakterisieren und möglicherweise Wege zur chemischen Therapeutika fördern kann Restaurierung Nephron Struktur nach Nierentransplantation Damm identifizieren bereitzustellenAlter.

Die Niere ist ein komplexes Organ, das eine Vielzahl von physiologischen Funktionen im Körper erfüllt. Der vorderste Funktion der Niere Stoffwechselausscheidung, und diese Aufgabe ist eng mit der Aufrechterhaltung der Homöostase Fluid verflochten. Die Niere führt diese Arbeitsplätze durch Filterung des Blutes und bilden Urin, während gleichzeitig die Regulierung des Blutdrucks, Elektrolyt-Niveau, und Säure-Basen-Gleichgewicht. Hoch spezialisierte Epithelzellen Tubuli genannt Nephronen dienen als Grundfunktionseinheit der Niere 1,2. Bei erwachsenen Wirbeltieren, sind Nephrone typischerweise in einer eng gewickelten Anordnung rund um eine zentrale Entwässerungssystem organisiert, so dass für viele Tubuli in das ziemlich kleine Orgel zu packen. Zum Beispiel kann jeder menschliche Niere über 1 Million Nephronen 3 enthalten. Andere Säugetiere wie die Maus besitzen in der Größenordnung von 8 bis 10.000 Nephrone pro Niere 4. Der Grad der Nieren Komplexität unterscheidet zwischen diesen Säugetieren und anderen vertebrates aufgrund von Variationen der Gesamtzahl Nephrons und ihre architektonische Gestaltung in der Niere. Wirbeltierarten bilden so viele wie drei aufeinander Nieren Strukturen während der Entwicklung, und jeder Form zeigt zunehmende Komplexität in Bezug auf Ausstattung und Anordnung nephron: die Vorniere, Urniere und Nachniere. Die letzte Nierenstruktur beibehalten werden dient als der adulten Niere Organ-Regel ein Mesonephros oder Metanephros 2. Jede Niere Form hat jedoch eine Nephron basierende Zusammensetzung 2. Das Nephron ist das Arbeitspferd der Niere und ist für die Blutfiltration mit Metaboliten Sekretion und Resorption verantwortlich. Nephrone sind einfache röhrenförmige Strukturen aus Epithelzellen besteht und eine segmentale Organisation, in der diskreten, hoch spezialisierten Bereichen von differenzierten Epithelien besondere Aufgaben. In der Reihenfolge der Filtrat Fluss durch das Nephron, gibt es in der Regel drei Hauptteile, die comprise jede Einheit: (1) die Nierenkörperchen, (2) ein Röhrchen mit proximalen, mittleren und distalen Segmenten, und (3) ein Sammelkanal 1. Der proximale Tubulus ist für die Resorption von gelösten organischen Stoffen, insbesondere Glucose und Aminosäuren 1 verantwortlich. Die Zwischenröhrchen (oder der Henle-Schleife) ist ein wichtiger Standort von Salz und Wasserregulierung 1. Schließlich erfolgt eine Feinabstimmung von Salz und anderen Ionen im distalen Tubulus und Sammelrohr und wird von endokrinen Systems 1 geregelt. Von dort wandert das Filtrat durch den Harnleiter und Blase letztlich Verlassen des Körpers als Abfallprodukt 1. Der Verlust der Nierenfunktion kann aus einer Vielzahl von Ursachen, die normale Aktivität Nephron verhindern stammen. Diese Ursachen können während der Nierenentwicklung, zB angeborene Defekte, die zur Fehlbildung der Nephrone 5, oder die Ursachen von verschiedenen Arten von Verletzungen führen (die sich aus sowohl genetische als auch environme auftretenNTAL Herkunft). Erworben Verletzungen werden allgemein als akute Nierenschädigung (AKI) oder chronischen Nierenversagen (CKD) kategorisiert. AKI beinhaltet einen abrupten Verlust der Nierenfunktion, die oft aus Ischämie oder Toxin Exposition 6,7 resultieren. Bei Säugetieren ist nephron epithelialen Reparatur möglich nach solchen Verletzungen 8, und viele Menschen zeigen volle Wiederherstellung der Nierenfunktion nach AKI. 70% Inzidenz Bereich 6,7 - ist jedoch auch AKI mit hoher Morbidität und Mortalität, die in einem breiten 30 berichtet wurde, verbunden. CKD dagegen mit fortschreitenden Verlust der Nierenfunktion, die von Jahren anhalt Schäden, typischerweise mit 8,9 Fibrose assoziiert Ergebnisse gelten. Ferner besteht ein Wechselspiel zwischen AKI und CKD, entweder kann man eine individuelle auf die andere 10-12 prädisponieren. Zum Beispiel diejenigen, die von AKI gelitten haben, sind anfälliger für CKD und sogar zum Tod 13. Das Auftreten von Nierenerkrankungen, sowohl in den USA und weltweit, hat epide erreichtmic Proportionen und wird sich voraussichtlich steigen, da die Bevölkerung im Alter erweitert-so gibt es einen wachsenden Bedarf an regenerativen Medizin Interventionen für die Niere 14,15 identifizieren. Trotz der Erkenntnis, dass AKI Patienten erholen kann, ist es schon lange gedacht, dass die Niere ist ein Organ, ohne angeborene regenerativen Kräfte. Dieses traditionelle Ansicht wurde in den letzten Jahren 16 überarbeitet. Studien, die Nierenschäden bei Mäusen und Ratten nach AKI haben gezeigt, dass Nephron Tubuli Epithelzellen vermehren und wieder aufzubauen funktionellen Nephronen 17-20. Obwohl Säugetiere besitzen diese Fähigkeit, adaptive Nephrone regenerieren, gibt es bemerkenswerte Einschränkungen und maladaptive Reaktionen ausgelöst werden, die zu Nierenfibrose und CKD 21 führen. Zum Beispiel eine aktuelle Studie gezeigt, dass wiederholte Epithelzellen Ablation in murinen Nephrone wurde mit verminderter Regeneration und Nierenfibrose-was darauf hindeutet, Nephrone hav verbundenea begrenzt Regenerationsschwelle 22. Es gibt keine Beweise dafür, dass der erwachsene Säugetierniere bildet neue Nephrone, um verlorene oder beschädigte zu ersetzen und damit deren Zerstörung führt zu einem permanenten Defizit 8,9 Nephrons. Interessanterweise haben einige Wirbeltiere zu reagieren AKI durch Regeneration nephron Epithelien und auch die Herstellung neuer Nephrone, bezeichnet ein Verfahren, das als neonephrogenesis oder nephron Neogenese 23. Neonephrogenesis tritt in Fisch nach Toxin Exposition oder teilweise Resektion und Verletzungen Modelle haben in der Vergangenheit waren die Goldfische 24,25, Tilapia 26, Skate-27, Medaka 28, und in jüngerer Zeit, der Zebrafisch 29,30. Von diesen Zebrafisch einen lebensfähigen genetischen Forschung Modell, um die zellulären und molekularen Signalwege für Nierenregeneration verantwortlich zu entdecken. In diesem Video-Artikel zeigen wir, wie man Nephronsegmenten in erwachsenen Zebrafisch zu kennzeichnen. Kenntnisse der Nephron Anatomie, molekularen Eigenschaften,und funktionellen Eigenschaften sind wesentlich für eine erfolgreiche Zukunft Nieren Studien mit Zebrafisch. Die erwachsenen Zebrafisch ist eine Niere Mesonephros Struktur und ist von Natur aus weniger komplex in Bezug auf die Anzahl und die Organisation Nephron als der Metanephros Struktur in der Erwachsenen Säugetieren, Vögeln und Reptilien 31 gefunden. Jedoch Zebrafisch Nephron Segment Organisation analog Säugetieren und wurde zuerst in der embryonalen Nieren basierend auf Genexpressionsstudien 31-35 dokumentiert. Zebrafischembryo Nephrone enthalten lineare Röhrchen Segmente, die den proximalen Konvolut (PCT) enthalten, proximalen Tubulus gerade (PST), distalen früh (DE), und distalen Ende (DL) 31-35 (Abbildung 1). Zebrafisch Erwachsenen Nephrone besitzen ähnliche Rohrsegmente 30,31,36,37 (Abbildung 1). Die PCT kann auch von einem funktionellen Phänotyps identifiziert werden: Epithelzellen in der PCT fluoreszierend markiertes Dextran-Verbindungen (10-70 kDa groß) in der vorliegenden integrierenKreislauf, der sowohl in der embryonalen und erwachsenen Zebrafisch Niere eingesetzt worden ist, um endozytischen Aufnahme durch diesen proximalen Tubuluszellen 38-41 (Abbildung 1) zu bewerten. Ein Unterschied in Nephronsegmenten zwischen Zebrafisch und Säugetiere ist, dass Zebrafisch fehlt ein Zwischenröhrchen oder der Henle-Schleife 30-37; Seit diesem Segment Funktionen bei Säugetieren, Wasser zu sparen, und Zebrafisch sind ein Süßwasserarten ohne Dringlichkeit, ihren Urin zu konzentrieren, ist es nicht verwunderlich, dass Zebrafisch fehlt dieses Segment 32,33. Somit wird die Gesamt Nephron Zusammensetzung weitgehend zwischen dem Zebrafisch und Säugetierniere 32,33 konserviert. Diese Ähnlichkeiten haben Zebrafisch ermöglicht, eine effektive Forschungswerkzeug, um die Funktionen der Nieren exprimierten Gene während der Entwicklungs Nephrogenese 32-35,42 untersuchen und zahlreiche Nierenerkrankungen 43,44 modelliert, wodurch zusätzlich zu den wesentlichen Liste menschlicher Bedingungen sein kann untersucht mitZebrafisch 45,46. Heute ist die erwachsenen Zebrafisch Niere ist ein attraktives Modell für vergleichende Studien der Nierenregeneration aufgrund seiner genetischen Lenkbarkeit und der Ausbau der technologischen Gaumen Ressourcen zur Verfügung zu Gen-Funktion und Signalwege in dieser Art zu verhören. Mehrere Studien haben die Zebrafisch-Mesonephros verwendet werden, um die Mechanismen der Regeneration nach AKI 29,30,37 zu untersuchen. Für die weitere Verwendung der AKI-Forschungs erwachsenen Zebrafisch Niere, ist es wichtig, exquisite Methoden, um verschiedene nephron Regionen und Methoden zu kennzeichnen, um nephron Funktionalität überblicken können. Mehrere Methoden für erwachsene Niere Analysen wurden aus embryonalen Nieren Protokolle angepasst. Intraperitoneale Injektion von Fluoreszenz-markierten Dextran im erwachsenen Zebrafisch bezeichnet die PCT-Epithel in Mesonephros Nephrone über Endozytose 30, wie in Zebrafischembryonen 38-41 (Abbildung 1). Diese Methode wurde verwendet, um visualize, wenn proximalen Tubuli wieder ihre resorbierbaren Eigentum folgenden AKI, die eine Beurteilung der physiologischen Funktion wiederhergestellt 30 (Abbildung 1) ermöglicht. Ein weiteres Merkmal des Nephrons proximalen Tubulus ist, dass die Epithelzellen in diesem Bereich besitzen einen Bürsten Grenze 37, die hohe endogene alkalische Phosphatase-Aktivität zeigt. Somit ist die proximale Epithel visuell im erwachsenen Zebrafisch Niere mit einem Fluoreszenz-basierten Technik, die als ELF (Enzym-markierten Fluoreszenz) bekannt -97 47 lokalisiert werden. Hier beschreiben wir, wie man fluoreszierenden Dextran-Aufnahme-Assays 30,48 im erwachsenen Zebrafisch Niere durchzuführen, um so eine funktionelle Beurteilung des proximalen Tubulus zu erhalten und ordnen Sie die Größe und Konturen dieses Röhrchen-Segment. Als nächstes beschreiben wir Verfahren zum proximalen Tubulus Regionen des adulten Nephron mit dem Fluoreszenzmarker alkalische Phosphatase zu markieren. Drittens zeigen wir zum ersten Mal, dass die rhodAmin-markiertem Lektin Dolichos biflorus-Agglutinin (DBA), die als allgemeiner Marker für die Sammelkanäle in der Säugetierniere 49 verwendet wurde, kennzeichnet den distalen Tubuli der Niere erwachsenen Zebrafisch. Als DBA sich gegenseitig aus der alkalischen Phosphatase-Färbung, diese Etiketten bieten eine Möglichkeit, im Großen und Ganzen unterscheiden gesamt proximalen gegenüber gesamt distalen Strecken des erwachsenen Zebrafisch Nephrons. Im Laufe der Umsetzung dieser fluoreszierenden Flecken sowohl ganze Berg und Kryostat histologischen Schnitten, korrelieren wir diese Etiketten mit Expressionsdomänen von gelösten Transportergene, die jedes Nephron Segment eindeutig zu identifizieren. Daher enthält dieses Protokoll auch eine Anleitung zu den veränderten Gewebeverarbeitungsverfahren für erwachsene Gewebe ganze Berg in-situ-Hybridisierung (WISH) Analyse auf der Grundlage unserer Embryo WISH Protokoll 50. Diese Verfahren können in verschiedenen Kombinationen (2), die zur morphologischen und funktionellen Eigenschaften zu dokumentieren of erwachsenen Zebrafisch Niere Nephrone. Somit können diese Protokolle Regenerationsstudien der phänotypischen Charakterisierung andere Nierenerkrankungen Modelle angewendet werden, und sogar zur Bildung von erwachsenen Niere zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>1X PBS</td><td></td><td></td><td>Made by diluting 10 X PBS in distilled water.</td></tr><tr><td>1X PBST</td><td></td><td></td><td>0.1% Tween-20 detergent in 1 X PBS.</td></tr><tr><td>1X PBS with 0.05 % Tween</td><td></td><td></td><td>0.05% Tween-20 detergent in 1 X PBS.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA/1X PBS</td><td></td><td></td><td>Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20&amp;deg;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Tweezers Pattern #55&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td>White Frost&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>Modeling clay</td><td>Hasbro</td><td>Playdoh</td><td>Other modeling clays can be substituted and work similarly</td></tr><tr><td>Slide holder</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-587</td><td>Optional: cardboard tray to store slides flat</td></tr><tr><td>Bleaching solution</td><td></td><td></td><td>Bleach mix formula (for a 20 ml solution):&lt;br/&gt; 1.6 ml of 10% Potassium hydroxide solution&lt;br/&gt; 0.6 ml of 30% Hydrogen peroxide solution&lt;br/&gt; 100 &amp;mu;l of 20% Tween&lt;br/&gt; Fill to 20 ml with distilled water</td></tr><tr><td>Potassium hydroxide</td><td>Sigma</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Blocking solution</td><td></td><td></td><td>Blocking Solution (for a 10 ml solution):&lt;br/&gt; 8 ml of 1X PBS with 0.05% Tween&lt;br/&gt; 2 ml of fetal calf serum&lt;br/&gt; 150 &amp;mu;l of DMSO</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase activity detection</td><td>Invitrogen</td><td>E6601</td><td>We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.&amp;nbsp; To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer&#039;s instructions.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase wash solution</td><td></td><td></td><td>Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 ml solution):&lt;br/&gt; 5 ml of 0.5 M EDTA&lt;br/&gt; 120 mg of Levamisole&lt;br/&gt; 95 ml of 1X PBS</td></tr><tr><td>Dextran, fluorescein, 40,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1844</td><td>Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Dextran, cascade blue, 10,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1976</td><td>Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1825</td><td>Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1817</td><td>Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td><td>Vector laboratories</td><td>RL-10-32</td><td>DBA Staining Solution (for a 100 &amp;mu;l solution):&lt;br/&gt; 1 &amp;mu;l of DBA&lt;br/&gt; 99 &amp;mu;l of 1X PBS</td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Invitrogen</td><td>E6601</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield hard set mounting medium</td><td>Vector laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>Micro cover glass</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide, DMSO</td><td>American Bioanalytical</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0289</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5 M solution, pH 8.0</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00502</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L-9756</td><td></td></tr><tr><td>Tissue freezing medium</td><td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td><td>TFM-C</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10 x 10x 5 mm</td><td>Sakura Finetek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>TruBond 380 adhesive microscope slides</td><td>Tru Scientific</td><td>0380W</td><td></td></tr><tr><td>Liquid blocker &amp;ndash; super PAP pen</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71312</td><td></td></tr><tr><td>Immuno stain moisture chamber</td><td>Evergreen Scientific</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Therm</td><td>Microm&amp;trade; HM 525 Cryostat</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC</td><td>Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Compound microscope</td><td>Nikon</td><td>96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td><td>Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney

Der Zebrafisch-Modell wurde als relevante System zu Nieren Entwicklung, Regeneration und Krankheit zu studieren entstanden. Sowohl die embryonalen und erwachsenen Zebrafisch Nieren von Funktionseinheiten wie Nephrone bekannt, die stark mit anderen Wirbeltieren, einschließlich Säugetieren konserviert sind zusammengesetzt. Forschung im Zebrafisch hat kürzlich gezeigt, dass zwei unterschiedliche Phänomene transpirieren nach Erwachsenen Nephrone Schaden nehmen: Erstens, es ist robust Regeneration im Rahmen der vorhandenen Nephrone, die die Epithelzellen zerstört Röhrchen ersetzt; Zweitens sind völlig neue Nephronen Nieren Vorläufern in einem als neonephrogenesis bekannt ist. Dagegen Menschen und anderen Säugern scheinen nur eine begrenzte Fähigkeit zur Nephron Epithelregeneration haben. Bis heute sind die Mechanismen für diese Phänomene Nierenregeneration verantwortlich bleiben kaum verstanden. Seit erwachsenen Zebrafisch Nieren unterziehen sowohl nephron epithelialen Regeneration und neonephrogenesis, bieten sie eine hervorragende experimentelle paraDIGM, um diese Ereignisse zu studieren. Weiterhin gibt es eine Vielzahl von genetischen und pharmakologische Werkzeuge im Zebrafischmodell, das verwendet werden kann, um die zellulären und molekularen Mechanismen, die die Nierenregeneration regulieren abzugrenzen. Ein wesentlicher Aspekt dieser Forschung ist die Auswertung von Nephron Struktur und Funktion. Dieses Protokoll beschreibt einen Satz von Markierungstechniken, die verwendet werden können, um Nieren Zusammensetzung und Test Nephron Funktion im adulten Zebrafisch Nieren messen. Somit sind diese Verfahren weithin für die Zukunft phänotypische Charakterisierung von erwachsenen Zebrafisch Nierenschädigung Paradigmen, die umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, nephrotoxicant Belichtungssysteme oder genetische Methoden der gezielten Zelltod wie Nitroreduktase vermittelte Zell Ablation Technik. Ferner könnte diese Methoden verwendet werden, um genetische Störungen in der Erwachsenenbildung Nieren studieren und könnte auch angewendet, um Nierenstatus während chronische Krankheit Modellierung zu bewerten.

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Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Der Zebrafisch adulten Niere ist ein ausgezeichnetes System für Nierenregeneration und Krankheit Studien. Ein wesentlicher Aspekt dieser Forschung ist die Beurteilung der nephron Struktur und Funktion. Dieses Protokoll beschreibt mehrere Methoden, die implementiert werden, um Nephron Tubuli Zusammensetzung zu beurteilen und renale Reabsorption zu bewerten.

Analyse der Nephron Zusammensetzung und Funktion im erwachsenen Zebrafisch Nieren

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

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Research

JoVE Journal

Biology

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Serie: Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Nieren-Regeneration im erwachsenen Zebrafisch durch Gentamicin induzierte Schädigung

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Analyse von Zebrabärbling Nierenentwicklung mit Zeitraffer-Imaging einem Binokular Mit Ausgerüstet für Optische Schnitte

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissection von Organen aus dem Adult Zebrafisch

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Biologie

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at 2 days post fertilization. Consisting of only two nephrons, the pronephros serves as the sole kidney during larval life until more renal function is required due to the increasing body mass. To cope with this higher demand, the mesonephros (adult kidney) begins to form during metamorphosis. The new primary nephrons fuse to the pronephros and form connected lumens. Then, secondary nephrons fuse to primary ones (and so on) to create a branching network in the mesonephros. The vast majority of research is focused on the pronephros due to the ease of using embryos. Thus, there is a need to develop techniques to study older and larger larvae and juvenile fish to better understand mesonephros development. Here, an in situ hybridization protocol for gene expression analysis is optimized for probe penetration, washing of probes and antibodies, and bleaching of pigments to better visualize the mesonephros. The Tg(lhx1a-EGFP) transgenic line is used to label progenitor cells and the distal tubules of nascent nephrons. This protocol fills a gap in mesonephros research. It is a crucial model for understanding how new kidney tissues form and integrate with existing nephrons and provide insights into regenerative therapies.

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish is an important model for understanding kidney development. Here, an in situ hybridization protocol is optimized to detect gene expression in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development.

In situ Hybridisierung in Zebrafischlarven und Jungfischen während der Mesonephrosentwicklung

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Präparation des Adult Zebrafisch Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Laser Ablation des Zebrafisch Vorniere auf Study Renal Epithelregeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney due to its low molecular weight. Such accumulation causes the death of tubular cells and can induce the development of Acute Kidney Injury (AKI), which is characterized by a quick decrease in kidney function, tissue damage, and immune cells infiltration. If administered in specific doses cisplatin can be a useful tool as an AKI inducer in animal models. The zebrafish has appeared as an interesting model to study renal function, kidney regeneration, and injury, as renal structures conserve functional similarities with mammals. Adult zebrafish injected with cisplatin shows decreased survival, kidney cell death, and increased inflammation markers after 24 h post-injection (hpi). In this model, immune cells infiltration and cell death can be assessed by flow cytometry and TUNEL assay. This protocol describes the procedures to induce AKI in adult zebrafish by intraperitoneal cisplatin injection and subsequently demonstrates how to collect the renal tissue for flow cytometry processing and cell death TUNEL assay. These techniques will be useful to understand the effects of cisplatin as a nephrotoxic agent and will contribute to the expansion of AKI models in adult zebrafish. This model can also be used to study kidney regeneration, in the search for compounds that treat or prevent kidney damage and to study inflammation in AKI. Moreover, the methods used in this protocol will improve the characterization of tissue damage and inflammation, which are therapeutic targets in kidney-associated comorbidities.

This protocol describes the procedures to induce Acute Kidney Injury (AKI) in adult zebrafish using cisplatin as a nephrotoxic agent. We detailed the steps to evaluate the reproducibility of the technique and two techniques to analyze inflammation and cell death in the renal tissue, flow cytometry and TUNEL, respectively.

Akute Nierenverletzung Modell induziert durch Cisplatin bei erwachsenen Zebrafischen

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

Medizin

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Bewertung der Zebrafisch Nierenfunktion unter Verwendung einer fluoreszierenden Räumungs Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Depigmentation and Prestaining of Zebrafish Kidney: A Technique to Prepare Adult Zebrafish Kidney for Staining

Source: McCampbell, K. K. et al. <a href="https://www.jove.com/video/51644" target="_blank">Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney.</a> J. Vis. Exp. (2014)
In this video, we demonstrate the depigmentation of adult zebrafish kidney and its subsequent preparation for staining procedures. Post-staining, the adult zebrafish kidney can be used for studying kidney regeneration, phenotypic characterization of renal disease models, and nephron functionality.