Общая цель этой процедуры, объясняется использование цисплатина в качестве нефротоксического агента у взрослых рыб зебры, анализируя воспаление, и гибель клеток в почечной ткани. Для достижения этой цели и взрослые рыбы зебры анестезируется и взвешивается, чтобы ввести в специфическую дозу цисплатина в брюшной полости. После мониторинга смертности, почки рассекают и клетки изолированы для цитометрии потока или фиксированной и вскрытой для анализа флуоресцентных АНАЛИЗ.
Следующие процедуры могут помочь ответить на ключевые вопросы в области почек с использованием нефротоксических эффектов цисплатина в качестве инструмента для разработки модели острой травмы почек и взрослых рыб-зебр. Эта модель может быть использована для исследования новых терапевтических целей в почечной защите, а также прояснить механизм регенерации в почках рыб зебры. Цисплатин является химиотерапевтическим агентом, используемым для лечения различных видов рака.
Однако, может легко накапливаться в почках, генерации клеточной смерти, воспаления, и уменьшить функцию почек. Эффект цисплатина зависит от дозы, так что вы можете снизить наше увеличение дозирования зависит от ваших целей. Методы, используемые здесь для анализа воспаления и клеточной смерти, не предназначены исключительно для распространения модели болезни.
Цитометрия потока у рыб-зебр может помочь прояснить воспалительные состояния животного в количественном выражении, в то время как в TUNEL мы говорим, может прояснить наличие poptosed клеток в физиологическом и патологическом контексте. Перед началом эксперимента подготовьте рабочий раствор цисплатина, разбавляя раствор бульона до 820 микрограммов на мил в 0,9% хлорида натрия. Затем обезболить другую рыбу зебры и высушить избыток воды на некоторых бумажных полотенец.
Взвешивайте рыбу, помещая их на весы, принимая к сведению вес. Сделайте расчеты, чтобы знать точный объем для инъекций. Для достижения дозы 120 микрограммов на грамм веса, используйте следующую формулу.
Разделите окончательную дозу на дозу рабочего раствора и преобразуй это число в микролитеры, умножая на 1000, чтобы получить объем 120 мкг цисплатина. Затем умножьте это число на вес рыбы, чтобы получить окончательный объем, который будет введен. Поместите рыбу на влажную губку, с маленькой чашкой, чтобы держать его.
С брюшной стороны вверх и заполнить инсулин шприц с расчетным объемом цисплатина. Вставьте иглу на брюшной средней линии под мелким углом, осторожно потянув брюшной стенки, чтобы избежать прокола внутренних органов. А потом впрыснуть раствор.
После инъекции поместите рыбу в бак, чтобы оправиться от анестезии, и ждать признаков восстановления, таких как плавание и соответствующие движения. Монитор для этого рыбы два раза в день в течение следующих дней. При такой дозе цисплатин вызывает около 30% смертности в первые 24 часа.
Усыпание рыбы и высушить избыток воды в бумажном полотенце. После удаления головы и внутренних органов, использовать вскрытия иглы, чтобы закрепить стенки тела. Найдите почку в спинной стенке рыбы и используйте типсы, чтобы отсоединить почку.
Поместите почку в шесть хорошо пластины с холодным раствором одного 1X PBS, 2%FBS и держать на льду. Затем возьмите ткань с некоторой жидкостью и передать его через 40 микрон-клеточный ситечко, и осторожно macerate ткани со шприцем поршень. Вымойте дважды с одним 1X PBS, 2%FBS.
И соберите клетки в соколиной трубке в 50 миль. Затем центрифуга в течение пяти минут при 400 Г.Осторожно пикап супернатант с пипеткой и отбросить его. Добавьте 500 микролитров холодного 1X PBS, чтобы повторно приостановить клетки и поместить их в пятимилю течь цитометрии трубки.
Держите их на льду. Возьмите 10 микролитров образца и смешайте его с 90 микролитров трипан-голубого цвета в трубке Эппендорфа. Добавьте 10 микролитров смеси в камеру Neobauer и подсчитайте клетки в микроскопе.
Возьмите клетки для чтения цитометром, а затем проанализировать результаты выбора населения ваших интересов. Для этой процедуры усытворяйте рыбу и удаляйте внутренние органы, оставляя почку прикрепленной к телу. Затем прикрепите стенки кузова к поверхности пробки и поместите ее на поэтапное решение фиксации.
Держите его на четыре градуса на ночь. На следующий день, вскрыть почку с тонкой типп. Старайтесь не нарушать его.
Поместите его в небольшую чашку Петри или Эппендорф трубку с 1X PBS для полоскания. Изменение PBS и подготовить 2%agarose для создания матрицы поддержки для почек, прежде чем они прочно процесса. Отбросьте все оставшиеся PBS и залить агарозу медленно.
Затем, положение почки с тонкой типсов для предотвращения его сложить. Пусть агароз затвердеет при комнатной температуре. После затвердевания агарозы используйте скальпель, чтобы разрезать агарозу вокруг почек, образуя мелкие кубики.
Поместите кубики агарозы в гистологическую кассету и отправьте их на гистологическую обработку для встраивания ткани в парафин. Парафин блоков, мы затем сократить в пять микрон толщиной разделов. Де-воск слайды и держать их в дистиллированной воде.
Подготовьте темную камеру инкубатора, положив мокрые бумажные полотенца на дно. Поместите слайды в темную камеру и добавьте протеиназу K для протеабилизации ткани. Инкубация в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия.
В то время как образцы инкубированы, подготовить смесь реакции TUNEL, добавив 50 микролитров ферментного раствора на 450 микролитров этикетки раствора. И держать защищены от света. Возьмите темную камеру и мыть ломтик дважды с одним 1X PBS.
Затем высушите слайды и на смеси реакции TUNEL. И инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение двух часов. После инкубации, мыть эти слайды снова с одним 1X PBS.
И добавить DAPI для ядра счетчик окрашивания. Инкубация при комнатной температуре в течение пяти минут, защищенная от света. Промыть три раза с одним 1X PBS.
А потом, плесень слайды с анти-fade гидрофильной среде. Поместите крышку скольжения. И печать с лаком для ногтей.
Визуализуууу в образцах флуоресцентного микроскопа. На этом графике можно увидеть, что цисплатин имеет эффект реакции дозы на выживание рыб, по сравнению с контролем, введенным только с 0,9% хлорида натрия. Красная линия на этом графике представляет собой дозу 120 микрограмм на грамм, используемую в этом видео.
Эти дозы могут быть применены к мужчинам и женщинам, так как статистической разницы между ними обнаружено не было. Цитометрия потока позволяет количественно оценить различные клетки, присутствующие в ткани. Популяции гематопоэтических клеток идентифицируются в почках нескольких рыб по размеру или форварду рассеяния и детализации или рассеяния размеров.
Таким образом, можно разделить популяции в эритроцитах, лимфоцитах, гранулоцитах и гематопоэтических прекурсорах. Здесь текущая стратегия ворот, выбираюющая гранулоциты, синглеты и положительные клетки МПО, позволяет найти популяцию нейтрофилов в почках, отмеченных флуоресценцией экспрессии миелопероксидазы. В этом случае инъекция цисплатина индуцировала увеличение доли нейтрофилов, присутствующих в почках.
Анализ TUNEL позволяет обнаружить апоптотические клетки в ткани, наблюдая слайд ткани почки с помощью флуоресцентного микроскопа, можно увидеть апоптотический сигнал внутри ядер некоторых клеток, здесь, в красном цвете. Контрастные ядерного пятна в таком DAPI здесь в синем. Инъекции цисплатина увеличили присутствие апоптотических клеток в почках, которые можно количественно количественно вручную или с помощью программного обеспечения изображения.
В конце этого видео вы должны быть в состоянии знать, как вводить и корректировать дозу цисплатина, чтобы вызвать острую травму почек у взрослых рыб зебры. И как вскрыть почку для разных целей. Цитометрия потока является отличным инструментом, который поможет вам понять профиль различных типов клеток в зависимости от наличия линий трагенклава в вашей лаборатории.
Не забудьте рассмотреть цвет линий транспортеров, если вы хотите использовать антитела для обозначения всех своих типов клеток. Анализ TUNEL является простым инструментом, который позволяет нам обнаружить апоптотические клетки и ткани, и может быть проанализирован не только с помощью микроскопии, но и поток цитометрии. Помните, всегда используйте средства индивидуальной защиты в течение всей процедуры.
