עבודה זו נתמכה על ידי מימון לRAW מבין האפשרויות הבאות: המכון הלאומי לבריאות מעניק K01 DK083512, DP2 OD008470, וR01 DK100237; מרס של # הפרס מענק של 5 FY12-75 הפרוטות הזיל אוקונור Starter Scholar; להתחיל את הכספים מאוניברסיטת נוטר דאם המכללה למדעים והמחלקה למדעים ביולוגיים; ומתנה נדיבה לאוניברסיטת נוטרדאם מאליזבת ומייקל גלאגר מטעם משפחת גלאגר לטפח מחקר בתאי גזע. היו לי המממנים שום תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, ההחלטה לפרסם, או ההכנה של כתב היד. אנו מודים לצוותות של המחלקה למדעי ביולוגיה על תמיכתם, והמרכז לחקר דג הזברה בנוטרה דאם למסירות היוצאות מן הכלל שלהם בטיפול והרווחה של המושבה דג הזברה שלנו. לבסוף, אנו מודים לחברים של מעבדת המחקר שלנו להערות, דיוניהם ותובנות על עבודה זו.

יש לי המחברים אין לחשוף.

הנה, יש לנו תארנו שיטות המאפשרות ההדמיה של רכיבי קטע נפרון בדג הזברה המבוגר. ההזרקה של conjugates dextran ניאון מאפשרת תיוג PCT מועדף בשל מאפייני endocytic של תאי אבובית הפרוקסימלי אלה 30,38. שיטה זו יכולה להתבצע עם גמישות רבה בשל קיומו של dextrans שניתן להשיג עם להקה של conjugates ניאון שונה. בנוסף, השימוש בdextrans יזין-ניתן לתקן הוא דרך נוחה במיוחד לתייג PCT מגזרים, כפי שנהלי תיוג משניים אינם נדרשים. זה מאפשר זיהוי אות פשוט יחסית והוא תואם עם הרבה מדבקות אחרות ניאון, immunolabeling, ושימוש בקווי כתב מהונדסים. תיוג phosphatase אלקליין גם מסמן את אבובית הפרוקסימלי, עם תגובתיות חזקה בPCT ותגובתיות מעט חלשה יותר בPST. לבסוף, מכתים DBA מאפשר סימון של קטעי אבובית דיסטלי, המציגים characteristic מסועף מורפולוגיה. מולקולות לקטינים שונות, אשר מחייב חלבוני סוכר ממוצא nonimmune, נעשו שימוש נרחב להבחין מגזרי נפרון היונקים 47. זה מעניין, כי DBA בדג הזברה בקורלציה עם מגזרי אבובית דיסטלי, כפי שהוא מנוצל לציון צינורות איסוף בכליות של יונקים 47. יחדיו, יכולות להיות מנוצלים בשיטות אלה בצירופים שונים כדי לתעד הרכב ובתפקוד כליות. מאחר וכל השיטות הללו ניתן להשתמש בתכשירי כליה שלמים, הם מספקים כלים להערכת מבנה נפרון ותפקוד לאורך האיבר ללא כל הסתמכות על השימוש של יותר זמן רב, שיטות מייגע, למשל, עבודת cryosection וimmunolabeling. עם זאת, הכתמים מתוארים במאמר זה הם שיטות קיימא בcryosection. ניתוח cryosection מייצר דגימות (בהשוואה להר שלם) שהם מתאימים יותר לאימונוהיסטוכימיה כדי לזהות pepti הספציפיdes, אם כי כמובן זה סוג של ניתוח דורש הזמינות של נוגדנים ראשוניים מתאימים. למרבה הצער מגבלה העיקרית אחת בעבודה עם מודל החיה דג הזברה נשארת עניה הזמינות של נוגדנים. כך המאחלים נשאר בשימוש נרחב ביותר, כלומר, &#39;ללכת ל, &quot;הליך לניתוח של ביטוי גנים. מאחל באמצעות תגובות מצע BCIP, NBT, ו / או INT לייצר משקעים סגולים או אדומים אינו תואם עם מכתים ניאון על cryosections. אפשרות אחת תהיה להפעיל את השימוש בזיהוי מאחלי ניאון, הליך שעבר אופטימיזציה עבור דגימות עוברי דג הזברה ויכול להיות מותאם לשימוש עם הכליה הבוגרת. התיאור של השיטות במאמר זה וידאו צריך לאפשר לניסויים נוספים עם טכניקות כמו מאחלי ניאון בשילוב עם קווי דג הזברה מהונדסים שבו קטעים בודדים מסומנים עם כתב כגון eGFP או mCherry. לחלופין, השיטות שתוארו כאן could להיבדק בשילוב עם צבעים אחרים חיוניים, למשל, לקטינים אחרים. לפיכך, הסתגלות והרחבת השיטות שתוארו כאן עוד יכולים להיות מופעלת כדי שיתאימו לצרכימים של החוקר להכנות הר שלמים בכליות וניתוח. ככזה, יש להם שיטות אלה פוטנציאל רחב ליישום עם מודל דג הזברה ללימודי התחדשות מתמשכים וגם בדוגמנות מחלה גנטית. יש צורך דחוף במחקר חדשני וטיפולים לייסורי כליות. מיליוני אנשים סובלים מצורה כלשהי של מחלת כליות בכל שנה כתוצאה מגורמים מולדים, אקוטיים, ו / או כרוניים. יתר על כן, השכיחות של מחלת כליות ממשיכה לעלות ברחבי העולם, מה שהופך את המחלות הללו נושא בריאות הציבור עולמי 14,15. טיפולים כגון המודיאליזה זמינים לפי מכונת דיאליזה חיצונית משמשת ללהיפטר הדם של מטופל של פסולת מטבולית אם הכליות שלהם אינן מסוגלות לבצע את התפקיד הזה. לרוע המזל, יש התערבות זו מגבלות, כטיפול מתמשך הוא הכרחי להישרדות. יתר על כן, חולי סופו של דבר דורשים השתלת כליה, אשר יכול לקחת שנים כדי לקבל פעם במטופל שוכבים על waitlist. גם לאחר קבלת להשתלת כליה, חולים רבים סובלים מתופעות לוואי כתוצאה מההליך וחייבים לקרב את ההשפעות הללו לשארית חייהם. קשיים אלה מדגימים את הצורך הרציני לפיתוח טיפולים חדשניים לאו לסייע במניעת מחלת כליות או כדי להגדיל את התחדשות רקמות 8,16,52,53 אולי. בהתחשב במגבלות האתיות הברורה של השימוש במבחן בבני אדם במעבדות ביו, מודלים של בעלי החיים הם חיוניים למחקר של היווצרות מחלה אנושית ועבור הבדיקות של טיפולים חדשים. כתוצאה מהדמיון האנטומי שלה וקרבה אבולוציונית, העכבר הפך המודל הנפוץ ביותר של מחלות בבני אדם 45. עם זאת, יש מגבלות מסוימות עם בעל חיים זה, including חוסר יכולת לחזות התפתחות איבר בגוף חי ומעשיות של השלמת מסכי גנטיים בקנה מידה גדולה. דג הזברה הוא אורגניזם מודל רלוונטי ושימושי ללימוד פיתוח איבר ומודלים למחלות אנושיות 45,46. בכל הקשור למחלות של בני אדם, homologs התפקודי בדג הזברה קיים עבור כמעט 70% מכל הגנים האנושיים 54,55. מחקר שנערך לאחרונה הדגיש את התועלת של דג הזברה לתחומים רבים של 31,37,56 מחקר כליות. מחקרים של התחדשות ותיקון בדג זברה לאחר AKI מצביעים על כך שהתחדשות אפיתל אבובית וneonephrogenesis הם שני תהליכים המתרחשים וחפיפה לאורך כל ההתחדשות timecourse 30,37. השימוש בגנטמיצין נקרא האנטיביוטיקה aminoglycoside נוצל כפרדיגמה פציעה אשר דרך ללמוד את התוצאות של AKI ב29,30,37 דג הזברה מבוגר. במהלך פציעה כשני שבוע תקופה שלאחר מגנטמיצין, טובול פרוקסימליes להתחדש, ובינתיים nephrons החדש להיווצר בכל רחבי האיבר 29,30,37. באופן כללי, המנגנונים המווסתים את התחדשות אפיתל יישארו שנויים במחלוקת. במנגנון מוצע אחד של תהליך התיקון, יש אירוע פציעה אקוטית הראשוני ואחריו השלת תאים מתים לתוך לומן. בשלב הבא, יש סדרה של דה בידול, התפשטות, ואירועי הגירה, לאחר שתאים חדשים לבדל, אכלוס מחדש את הקרום במרתף נפצע ושחזור פונקציה לאתר נפצע. לחלופין, מחקרים אחרים הראו כי תאים חלופיים נובעים מתאי גזע / אב המתגוררים בתוך צינוריות נפרון. באשר לתהליך של neonephrogenesis בדג זברה, אגרגטים הסלולר נצפו AKI הבא על ידי הזרקת גנטמיצין 29,30. אגרגטים אלה מאוחר יותר יבשילו לnephrons החדש שאנך לצינוריות כבר קיימות 29,30. החוט המקשר, המאחד התחדשות אפיתל נפרון וneonephrogenesis הוא גורם המסתורין המוחלט שלהם: כיום יש באופן אקספוננציאלי יותר שאלות על איך מעללי משובי הללו מתרחשים מאשר יש תובנות זמינות. עד כה, עם זאת, כמה שורות מרגשות של ראיות תומכות ברעיון שמחקר התחדשות כליות באמצעות דג הזברה אכן יכול לספק תובנות השוואתיות רלוונטיות לAKI האנושי שיכול להיות גם 56-58 פוטנציאל translational ישיר. הקרנה כימית לזהות מולקולות קטנות המגבירות את השגשוג של תאי אב כליות בעובר דג הזברה, הביא לאחרונה לזיהוי -butanoate מעכב deacetylase היסטון מתיל-4 (phenylthio) (m4PTB) 56,57. מנהל של תרכובת זו לזחלי דג הזברה עם AKI-Induced גנטמיצין גילה כי הישרדות זחל גדלה ושהשגשוג צינורי הכליות היה משופר 56,58. כאשר עכברים עם AKI-Induced איסכמיה המתון טופלו בm4PTB, ההתאוששות שלהם הואצה בassociation עם ירידה בשני מעצר הניוון ומחזור התא צינורי של תאים מתרבים צינורי כליות 58. ממצאים אלה מראים כי המסלולים אחראים להתפתחות תקינה של דג הזברה כליה ו / או תגובת משובי לאקי יהיו נשמרים עם יונקים 56. וכך, בעוד יש צורך במחקרים נוספים כדי להפריד את מנגנוני התחדשות, כלומר לזהות את מסלולי האיתות כי הם מעורבים ולהבין האינטראקציות-דג הזברה שלהם מספקת השדרה מבטיחה אחד להמשיך מטרה חשובה זו בתחום נפרולוגיה. כלים כגון תוויות תא נפרון המתוארות בפרוטוקול זה מייצגים קבוצה אחת של מבחני שיכולים להיות מנוצל כדי להעריך הרכב ופונקציונליות כליות במודלי AKI. יתר על כן, הם יכולים להיות מיושמים לאפיין מודלים מהונדסים של מחלת כליות ועשויים לספק דרכים לזיהוי תרופות כימיות מסוגלות לקדם שיקום של מבנה נפרון לאחר סכר הכליהגיל.

הכליות היא איבר מורכב המקיים מספר רב של פונקציות פיסיולוגיות בגוף. הפונקציה החשובה ביותר של הכליות היא הפרשת פסולת המטבולית, ומשימה זו כרוכה באופן הדוק עם השמירה על הומאוסטזיס נוזל. הכליות מבצעת עבודות אלה על ידי סינון הדם ויצירת שתן, ואילו במקביל ויסות לחץ דם, רמות אלקטרוליטים, ואיזון חומצה בסיס. צינוריות אפיתל מאוד מיוחדות הנקראות נפרונים לשמש כיחידה תפקודית הבסיסית של הכליות 1,2. בבעלי חוליות מבוגרות, nephrons מאורגן בדרך כלל בהסדר מותח ביותר המקיף את מערכת ניקוז מרכזית, ובכך מאפשר לצינוריות רבות לארוז לתוך האיבר קטן למדי. לדוגמא, כל כליה אנושית יכולה להכיל מעל 1 מיליון nephrons 3. יונקים אחרים כמו העכבר להחזיק על סדר 8-10,000 nephrons לכליות 4. מידת המורכבות של כליות שונות בין יונקים אלה וvert האחרebrates בשל שינויים במספר כולל נפרון והפריסה האדריכלית שלהם בתוך הכליות. מינים של בעלי חוליות בצורה רבות כמו שלושה מבנים רצופים בכליות במהלך פיתוח, וכל אחד מציג טופס הגדלת מורכבות בכל קשור לתרומת נפרון והסדר: pronephros, כליה בינים, וmetanephros. מבנה הכליות האחרון להישמר משמש ככליה מבוגרת איבר בדרך כלל כליה בינים או metanephros 2. כל טופס בכליות, לעומת זאת, יש לו הרכב מבוסס נפרון 2. נפרון הוא סוס העבודה של הכליות והוא אחראי על סינון דם יחד עם הפרשת המטבוליט וספיגה. Nephrons הם מבנים צינוריים פשוטים מורכבים מתאי אפיתל ויש לי ארגון מגזרי, שבו תחומים דיסקרטיים, מאוד מיוחדים האפיתלים מובחנים לבצע משימות ספציפיות. בצו של זרימת תסנין דרך נפרון, יש בדרך כלל שלושה חלקים עיקריים שcomprisדואר כל יחידה: (1) גופיף הכליה, (2) אבובית עם הפרוקסימלי, ביניים, ומגזרי דיסטלי, ו (3) צינור איסוף 1. אבובית הפרוקסימלי היא אחראית לספיגה החוזרת של מומסים אורגניים, בעיקר חומצות אמינו וגלוקוז 1. אבובית ביניים (או הלולאה של הנלה) היא אתר מרכזי של רגולציה מלח ומים 1. לבסוף, כוונון עדין של מלח ויונים אחרים מתרחש באבובית דיסטלי וצינור איסוף ומוסדר מאוד על ידי המערכת האנדוקרינית 1. משם, התסנין עובר דרך השופכן ושלפוחית ​​השתן, סופו של דבר לצאת מהגוף כתוצר פסולת 1. אובדן התפקוד הכלייתי יכול לנבוע ממספר רב של גורמים המונעים פעילות נפרון נורמלית. גורמים אלה יכולים להתרחש במהלך התפתחות כליות, למשל, מומים מולדים הגורמים לעיוות של nephrons 5, או גורמים מסוגים שונים של פציעה (שנובעים משני גנטי וenvironmeמקורות פתיחות opening סגירות closures). פציעות שנרכשו מסווגות רחב כפגיעה אקוטית בכליות (AKI) או פגיעה כרונית בכליות (CKD). AKI כרוך אובדן פתאומי של תפקוד הכלייתי, לעתים קרובות כתוצאה מאיסכמיה או רעלן החשיפה 6,7. ביונקים, תיקון אפיתל נפרון הוא אפשרי לאחר פציעות כגון 8, ואנשים רבים להציג שיקום מלא של תפקוד הכלייתי לאחר AKI. עם זאת, AKI קשור גם גבוהה תחלואה ותמותה שדווחו ברחבי 30 רחב - טווח שכיחות 70% 6,7. מחלת כליות כרונית, לעומת זאת, קשורה לאובדן הדרגתי של תפקוד כליות כתוצאה משנים של נזק ממושך, בדרך כלל קשור עם סיסטיק 8,9. יתר על כן, יחסי גומלין קיים בין AKI וCKD, כמו גם אחד יכול להטות מראש פרט ל10-12 האחר. לדוגמא, אלה שסבלו מAKI רגישים יותר למחלת כליות כרונית ואף למוות 13. השכיחות של מחלת כליות, גם בארה&quot;ב ובעולם, הגיעה epideפרופורציות ומיקרופון צפויים לעלות כאוכלוסייה בגילים מתרחבת-לכן יש צורך הולך וגדל לזהות התערבויות רפואת רגנרטיבית לכליות 14,15. למרות הידיעה שחולי AKI יכולים לשחזר, זה כבר זמן רב חשב כי הכליות הוא איבר ללא סמכויות משובי מולדים. השקפה מסורתית זו תוקן באופן דרמטי בשנים האחרונות 16. מחקרים חוקרים נזק כלייתי בעכברים וחולדות לאחר AKI הראו כי תאי אפיתל אבובית נפרון יכולים להתרבות ולבנות מחדש nephrons הפונקציונלי 17-20. למרות יונקים בעלי יכולת הסתגלות זה להתחדש nephrons, יש מגבלות בולטות ותגובות הסתגלות יכולה להיות מופעלות על אשר תוביל לסיסטיק כליות ומחלת הכליות כרוני 21. לדוגמא, מחקר שנערך לאחרונה הוכיח כי אבלציה תאי אפיתל החוזרת ונשנית בnephrons העכברי הייתה קשורה עם התחדשות מצומצמת וnephrons מרמז-סיסטיק כליות havea מוגבל סף התחדשות 22. אין ראיות לכך שהכליות של יונקים הבוגרים מהוות nephrons החדש כדי להחליף את אלה שאבדו או ניזוקו, ובכך ההרס שלהם מוביל לגירעון נפרון 8,9 קבוע. מעניין, כמה בעלי חוליות מגיבות לאקי על ידי התחדשות epithelia נפרון וגם על ידי הפקת nephrons החדש, תהליך המכונה neonephrogenesis או נפרון neogenesis 23. Neonephrogenesis מתרחש בדגים לאחר חשיפת רעלן או כריתה חלקית, ומודלי פציעה באופן הסטורי כללו את דג הזהב 24,25, אמנון 26, להחליק 27, medaka 28, ולאחרונה, דג הזברה 29,30. מתוכם, דג הזברה לספק מודל מחקר גנטי קיימא לגלות מסלולים התאיים ומולקולריים אחראים להתחדשות כליות. במאמר זה וידאו, אנו מדגימים כיצד לתייג מגזרי נפרון בדג זברה מבוגרת. ידע של האנטומיה נפרון, תכונות מולקולריות,ומאפיינים פונקציונליים חיוניים למחקרי כליות עתיד מוצלחים באמצעות דג הזברה. כליות דג הזברה מבוגרת היא מבנה כליה בינים והוא מטבעו פחות מורכב במונחים של מספר נפרון וארגון מאשר מבנה metanephros מצא ביונקים בוגרים, avians, וזוחלים ביום 31 ב. עם זאת, ארגון קטע נפרון דג הזברה הוא דומה ליונקים, ותועד לראשונה בכליה העוברית מבוססת על מחקרי ביטוי גני 31-35. nephrons עובר דג הזברה מכיל מקטעים ליניארי אבובית הכוללים הפרוקסימלי אבובית המפותלת (PCT), אבובית הפרוקסימלי ישרה (PST), דיסטלי המוקדם (DE), ודיסטלי מאוחר (DL) 31-35 (איור 1). nephrons המבוגר דג הזברה יש מגזרים צינורי דומים 30,31,36,37 (איור 1). PCT יכול גם להיות מזוהה על ידי פנוטיפ פונקציונלי: תאי האפיתל בPCT ישלבו תרכובות שכותרתו fluorescently dextran (10-70 KDA בגודל) נוכחת בבמחזור, אשר שימוש בו בשתי כליות דג הזברה העוברית ובוגרות להעריך ספיגת endocytic על ידי התאים אלה אבובית הפרוקסימלי 38-41 (איור 1). הבדל אחד במגזרי נפרון בין דג הזברה ויונקים הוא שדג זברה חסר אבובית ביניים, או לולאה של Henle 30-37; מאז פונקציות מגזר זה ביונקים כדי לחסוך במים, ודג זברה הן מיני מים מתוקים בלי דחיפות להתרכז השתן שלהם, אין זה מפתיע שדג זברה חסר מגזר זה 32,33. לפיכך, הרכב נפרון הכולל נשמרת במידה רבה בין דג הזברה והכליות של יונקים 32,33. קווי דמיון אלה אפשרו דג הזברה להיות כלי מחקר יעילים כדי לחקור את הפונקציות של גנים הביעו כליות במהלך nephrogenesis התפתחותית 32-35,42 ולהדגים מחלות כליה רבות 43,44, ובכך מוסיף לרשימה המשמעותית של תנאים אנושיים שיכול להיות נחקר באמצעותדג הזברה 45,46. היום, בכליות דג הזברה מבוגרת היא מודל אטרקטיבי ללימודים השוואתיים של התחדשות כליות עקב tractability הגנטי שלו וחיך הרחבת של משאבים טכנולוגיים העומד לרשות לחקור את תפקוד גן ומסלולי איתות במין זה. מספר מחקרים השתמשו בכליה ביני דג הזברה כדי לחקור את המנגנונים של התחדשות לאחר AKI 29,30,37. למחקר AKI המשיך באמצעות כליות דג הזברה מבוגרת, זה הכרחי יש שיטות מעודנות לתייג אזורי נפרון שונים ושיטות סקר פונקציונלי נפרון. מספר שיטות לניתוח בכליות מבוגר הותאמו מפרוטוקולי כליה עובריים. זריקת intraperitoneal של dextran שכותרתו fluorescently בדג הזברה המבוגר תוויות האפיתל PCT בnephrons כליה בינים באמצעות אנדוציטוזה 30, כמו בעוברי דג הזברה 38-41 (איור 1). שיטה זו נעשתה שימוש כדי visualizדואר כאשר צינוריות הפרוקסימלי חזרה את רכושם reabsorbing הבאות AKI, המאפשר הערכה אחת של פונקציה פיזיולוגית המשוחזר 30 (איור 1). תכונה נוספת של אבובית הפרוקסימלי נפרון היא שתאי האפיתל במגזר זה יש גבול מברשת 37 שמראה רמות גבוהות של פעילות phosphatase אלקליין אנדוגני. לפיכך, האפיתל הפרוקסימלי יכול להיות מקומי חזותי בכליות דג הזברה מבוגרות תוך שימוש בטכניקת הקרינה מבוססת הידוע בשם (הקרינה אנזים שכותרתו) ELF- -97 47. כאן, אנו מתארים כיצד לבצע מבחני ספיגת dextran ניאון 30,48 בכליות דג הזברה מבוגרות, כדי להשיג הערכה תפקודית של אבובית הפרוקסימלית ולמפות את הגודל וקווי מתאר של קטע אבובית זה. בשלב הבא, אנו מתארים טכניקות לתייג אזורי אבובית הפרוקסימלי של נפרון המבוגר עם phosphatase אלקליין תווית הניאון. שלישית, אנו מציגים בפעם הראשונה שRhodאמין מתויג הקטינים Dolichos biflorus agglutinin (DBA), אשר שימש כסמן כללי של צינורות האיסוף בכליות של היונקים 49, מסמן את המבנים צינוריים של הכליה דג הזברה מבוגרת. כDBA הוא מוציאים לצביעת phosphatase אלקליין, תוויות אלה מספקים דרך להבחין מחבת-הפרוקסימלי לעומת מתיחות מחבת-הדיסטלי של נפרון דג הזברה המבוגר באופן רחב. אורך יישום כתמי ניאון אלה בשני הר שלם וסעיפים היסטולוגית cryostat, אנו לתאם תוויות אלה עם תחומים ביטוי של גני טרנספורטר המומס כי לזהות כל מגזר נפרון. לכן פרוטוקול זה מכיל גם מדריך לנהלים שונה רקמת עיבוד להר שלם רקמות בוגרות בכלאה באתר ניתוח (לוואי) המבוססים על פרוטוקול מאחלי העובר שלנו 50. נהלים אלה יכולים להיות o משמשים בשילובים שונים (איור 2) לתיעוד תכונות מורפולוגיות ותפקודיותnephrons הכליה דג הזברה המבוגר f. כך, יכולים להיות מיושמים בפרוטוקולים אלה ללימודי התחדשות, האפיון פנוטיפי של מודלים מחלת כליות אחרים, ואפילו בשימוש ללמוד היווצרות של הכליה מבוגרת.

<table><tbody><tr><td>1X PBS</td><td></td><td></td><td>Made by diluting 10 X PBS in distilled water.</td></tr><tr><td>1X PBST</td><td></td><td></td><td>0.1% Tween-20 detergent in 1 X PBS.</td></tr><tr><td>1X PBS with 0.05 % Tween</td><td></td><td></td><td>0.05% Tween-20 detergent in 1 X PBS.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA/1X PBS</td><td></td><td></td><td>Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20&amp;deg;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Tweezers Pattern #55&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td>White Frost&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>Modeling clay</td><td>Hasbro</td><td>Playdoh</td><td>Other modeling clays can be substituted and work similarly</td></tr><tr><td>Slide holder</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-587</td><td>Optional: cardboard tray to store slides flat</td></tr><tr><td>Bleaching solution</td><td></td><td></td><td>Bleach mix formula (for a 20 ml solution):&lt;br/&gt; 1.6 ml of 10% Potassium hydroxide solution&lt;br/&gt; 0.6 ml of 30% Hydrogen peroxide solution&lt;br/&gt; 100 &amp;mu;l of 20% Tween&lt;br/&gt; Fill to 20 ml with distilled water</td></tr><tr><td>Potassium hydroxide</td><td>Sigma</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Blocking solution</td><td></td><td></td><td>Blocking Solution (for a 10 ml solution):&lt;br/&gt; 8 ml of 1X PBS with 0.05% Tween&lt;br/&gt; 2 ml of fetal calf serum&lt;br/&gt; 150 &amp;mu;l of DMSO</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase activity detection</td><td>Invitrogen</td><td>E6601</td><td>We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.&amp;nbsp; To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer&#039;s instructions.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase wash solution</td><td></td><td></td><td>Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 ml solution):&lt;br/&gt; 5 ml of 0.5 M EDTA&lt;br/&gt; 120 mg of Levamisole&lt;br/&gt; 95 ml of 1X PBS</td></tr><tr><td>Dextran, fluorescein, 40,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1844</td><td>Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Dextran, cascade blue, 10,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1976</td><td>Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1825</td><td>Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1817</td><td>Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td><td>Vector laboratories</td><td>RL-10-32</td><td>DBA Staining Solution (for a 100 &amp;mu;l solution):&lt;br/&gt; 1 &amp;mu;l of DBA&lt;br/&gt; 99 &amp;mu;l of 1X PBS</td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Invitrogen</td><td>E6601</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield hard set mounting medium</td><td>Vector laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>Micro cover glass</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide, DMSO</td><td>American Bioanalytical</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0289</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5 M solution, pH 8.0</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00502</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L-9756</td><td></td></tr><tr><td>Tissue freezing medium</td><td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td><td>TFM-C</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10 x 10x 5 mm</td><td>Sakura Finetek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>TruBond 380 adhesive microscope slides</td><td>Tru Scientific</td><td>0380W</td><td></td></tr><tr><td>Liquid blocker &amp;ndash; super PAP pen</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71312</td><td></td></tr><tr><td>Immuno stain moisture chamber</td><td>Evergreen Scientific</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Therm</td><td>Microm&amp;trade; HM 525 Cryostat</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC</td><td>Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Compound microscope</td><td>Nikon</td><td>96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td><td>Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney

מודל דג הזברה התפתח כמערכת רלוונטית ללימודי פיתוח בכליות, התחדשות ומחלה. שני כליות דג הזברה העוברית ובוגרות מורכבות מיחידות פונקציונליות הידוע בשם nephrons, אשר שמורות ביותר עם חוליות אחרות, לרבות יונקים. מחקר בדג הזברה הוכיח לאחרונה כי שתי תופעות ייחודיות להתרחש לאחר nephrons המבוגר להיגרם נזק: ראשון, יש התחדשות חזקה בתוך nephrons הקיים המחליף את תאי האפיתל אבובית נהרסו; שני, nephrons החדש לחלוטין המיוצר מאבות כליות בתהליך המכונה neonephrogenesis. בניגוד לכך, נראה שבני אדם ויונקים אחרים יש יכולת מוגבלת בלבד להתחדשות אפיתל נפרון. נכון להיום, את המנגנונים אחראים לתופעות התחדשות כליות אלה יישארו הבינו היטב. מאז כליות דג הזברה מבוגרות לעבור שתי התחדשות אפיתל נפרון וneonephrogenesis, הם מספקים סעיף ניסיוני מצטייןdigm ללמוד את האירועים הללו. יתר על כן, יש מגוון רחב של כלים גנטיים ותרופתיים זמינים במודל דג הזברה, שניתן להשתמש כדי להתוות מנגנונים התאיים ומולקולריים המווסתים את התחדשות כליות. היבט חיוני אחת של מחקר כזה הוא ההערכה של מבנה נפרון ותפקוד. פרוטוקול זה מתאר קבוצה של טכניקות תיוג כי ניתן להשתמש כדי לאמוד את הרכב כליות ופונקציונליות נפרון המבחן בכליות דג הזברה המבוגר. לפיכך, שיטות אלה הן נרחב החלים על האפיון פנוטיפי העתיד של פרדיגמות מבוגרות דג הזברה פגיעה בכליות, אשר כוללות, אך אינם מוגבלות, למשטרי חשיפת nephrotoxicant או שיטות גנטיות של מוות של תאים ממוקדים כגון טכניקת אבלציה תא nitroreductase בתיווך. יתר על כן, ניתן להשתמש בשיטות אלה כדי ללמוד הפרעות גנטיות בהיווצרות כליה מבוגרת ויכולות להיות מיושמות גם כדי להעריך את מצב כליות במהלך דוגמנות מחלה כרונית.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney at JoVE.com

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

הכליות מבוגרות דג הזברה היא מערכת מצוינת ללימודי התחדשות ומחלת כליות. היבט חיוני של מחקר כזה הוא ההערכה של מבנה נפרון ותפקוד. פרוטוקול זה מתאר כמה שיטות שניתן ליישם על מנת להעריך הרכב אבובית נפרון ולהעריך את ספיגה של כליות.

ניתוח של הרכב נפרון ותפקוד בכליות דג הזברה למבוגר

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

analysis-nephron-composition-function-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

43.9K Views.  University of Notre Dame.  הכליות מבוגרות דג הזברה היא מערכת מצוינת ללימודי התחדשות ומחלת כליות. היבט חיוני של מחקר כזה הוא ההערכה של מבנה נפרון ותפקוד. פרוטוקול זה מתאר כמה שיטות שניתן ליישם על מנת להעריך הרכב אבובית נפרון ולהעריך את ספיגה של כליות. 

Video: Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissection של איברים מן דג הזברה למבוגרים

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at 2 days post fertilization. Consisting of only two nephrons, the pronephros serves as the sole kidney during larval life until more renal function is required due to the increasing body mass. To cope with this higher demand, the mesonephros (adult kidney) begins to form during metamorphosis. The new primary nephrons fuse to the pronephros and form connected lumens. Then, secondary nephrons fuse to primary ones (and so on) to create a branching network in the mesonephros. The vast majority of research is focused on the pronephros due to the ease of using embryos. Thus, there is a need to develop techniques to study older and larger larvae and juvenile fish to better understand mesonephros development. Here, an in situ hybridization protocol for gene expression analysis is optimized for probe penetration, washing of probes and antibodies, and bleaching of pigments to better visualize the mesonephros. The Tg(lhx1a-EGFP) transgenic line is used to label progenitor cells and the distal tubules of nascent nephrons. This protocol fills a gap in mesonephros research. It is a crucial model for understanding how new kidney tissues form and integrate with existing nephrons and provide insights into regenerative therapies.

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish is an important model for understanding kidney development. Here, an in situ hybridization protocol is optimized to detect gene expression in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development.

בסיטו הכלאה בזחלי זברה וצעירים במהלך פיתוח מסונפרוס

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissection של הכליה דג הזברה למבוגרים

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

אבלציה בלייזר של דג הזברה כלית ראשית לחקר התחדשות אפיתל הכליה

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney due to its low molecular weight. Such accumulation causes the death of tubular cells and can induce the development of Acute Kidney Injury (AKI), which is characterized by a quick decrease in kidney function, tissue damage, and immune cells infiltration. If administered in specific doses cisplatin can be a useful tool as an AKI inducer in animal models. The zebrafish has appeared as an interesting model to study renal function, kidney regeneration, and injury, as renal structures conserve functional similarities with mammals. Adult zebrafish injected with cisplatin shows decreased survival, kidney cell death, and increased inflammation markers after 24 h post-injection (hpi). In this model, immune cells infiltration and cell death can be assessed by flow cytometry and TUNEL assay. This protocol describes the procedures to induce AKI in adult zebrafish by intraperitoneal cisplatin injection and subsequently demonstrates how to collect the renal tissue for flow cytometry processing and cell death TUNEL assay. These techniques will be useful to understand the effects of cisplatin as a nephrotoxic agent and will contribute to the expansion of AKI models in adult zebrafish. This model can also be used to study kidney regeneration, in the search for compounds that treat or prevent kidney damage and to study inflammation in AKI. Moreover, the methods used in this protocol will improve the characterization of tissue damage and inflammation, which are therapeutic targets in kidney-associated comorbidities.

This protocol describes the procedures to induce Acute Kidney Injury (AKI) in adult zebrafish using cisplatin as a nephrotoxic agent. We detailed the steps to evaluate the reproducibility of the technique and two techniques to analyze inflammation and cell death in the renal tissue, flow cytometry and TUNEL, respectively.

מודל פגיעה בכליות חריפה המושרה על ידי ציספלטין בדג זברה למבוגרים

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

Medicine

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

הערכה של תפקוד כליה דג הזברה באמצעות assay עמילות פלורסנט

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Depigmentation and Prestaining of Zebrafish Kidney: A Technique to Prepare Adult Zebrafish Kidney for Staining

Source: McCampbell, K. K. et al. <a href="https://www.jove.com/video/51644" target="_blank">Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney.</a> J. Vis. Exp. (2014)
In this video, we demonstrate the depigmentation of adult zebrafish kidney and its subsequent preparation for staining procedures. Post-staining, the adult zebrafish kidney can be used for studying kidney regeneration, phenotypic characterization of renal disease models, and nephron functionality.