Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии. Такие, как, определяя, как моноцитов подмножества пропорций, или выражение различных маркеров, изменяются в состояниях болезни. Основным преимуществом этой техники, является то, что клетки находятся рядом с их родным состоянием, и что четкие инструкции и оправдания используются, чтобы обеспечить стандартизированный метод закрытости.
Как правило, лица, новые для этого метода могут бороться, потому что многие документы не дают четких инструкций о том, как gating клеток была выполнена. Начните этот протокол со сбора образцов крови и определения белого анализа клеток крови, как описано в текстовом протоколе. Разбавить кровь фосфатно-буферным солевым раствором, чтобы скорректировать концентрацию примерно до 5 миллионов белых кровяных телец на миллилитр.
Подготовьте достаточную мастер-микст для количества трубок путем объединения крови, анти CD14-V450, анти CD16-APC и анти HLA-DR-PerCP. Вихрь и пипетка 51,9 микролитров смеси в каждой трубке. Добавить PE помечены M1 и M2 маркер антитела, а также маркеры для Т-клеток, В-клеток, нейтрофилов и естественных клеток-убийц в соответствующие трубки.
Вихрь и инкубировать в течение 30 минут при четырех градусах по Цельсию в темноте. Теперь добавьте 250 микролитров комбинированного лиза красных кровяных телец и раствора фиксации белых кровяных клеток, и сразу же вихрем смеси, осторожно. Инкубировать вихревую смесь в течение 10 минут в темноте, при четырех градусах по Цельсию.
Через 10 минут добавьте 250 микролитров PBS и вращайте клетки при температуре 260г в течение 10 минут при комнатной температуре. Удалить супернатант, и повторного перерасхода клеток в 300 микролитров 1%формальдегида. Храните клетки при четырех градусах цельсия, защищенных от света до тех пор, пока не будет проведен анализ.
Цитометрия потока должна быть выполнена в течение 48 часов после подготовки образца. Для начала проверьте журнал цитометра потока, чтобы убедиться, что персонал предприятия провел проверку качества. Чтобы настроить эксперимент по цитометрии потока, нажмите на новый эксперимент, за которым последуют новый образец и новая трубка, чтобы добавить трубки.
Выберите двувариантные сюжеты, нажав на значок, и используйте меню высадки, чтобы выбрать параметры доступа. Обеспечим включение участка CD16/CD14 и участка, отображая детектор вместе со временем, чтобы контролировать приобретение. Вставьте трубку и нажмите кнопку, приобрести.
Проверьте настройки напряжения прибора, гарантируя, что сигналы детектора не заходят в масштаб. Наблюдайте за клетками, падающими в моноцитные ворота участка CD14/CD16. Установите порог записи до 5000 событий для классических ворот моноцитов и нажмите на запись.
Продолжайте записывать данные по оставшимся трубам. После записи данных по всем трубам экспортируют данные потока в качестве файлов fcs для анализа. Для выполнения моноцитов gating, открытые файлы в программном обеспечении анализа, дважды нажмите на имя трубки, и выбрать параметры из меню высадки, чтобы визуализировать клетки на области вперед рассеяния по сравнению с вперед рассеяния высоты участка.
Создайте двойные ворота исключения, нажав на значок инструмента полигонных ворот и пригородив ячейки. Выберите закрытые ячейки, дважды нажав на закрытый регион. В новом поле дисплея отрегулируйте параметры меню высадки для отображения ячеек на области пересадок по сравнению с участком области бокового рассеяния.
Нажмите на значок прямоугольных ворот и щедро выберите популяцию моноцитов, основываясь на свойствах рассеяния вперед и сбоку, чтобы исключить большинство лимфоцитов, естественных клеток-убийц и гранулоцитов. Выберите закрытые ячейки и переиграйте на сюжете CD14/CD16, выбрав параметры с помощью меню высадки. Нажмите на ворота полигона, чтобы выбрать моноциты на основе их характерной, перевернутой формы l.
Если неклассической популяции не отличается от клеток слева от нее, то загрязнение, вероятно, и должны быть исследованы. Выберите закрытые ячейки и отобразить моноциты на участке CD/16 HLA-DR, используя меню высадки для выбора параметров. Нажмите на ворота полигона, чтобы выбрать HLA-DR положительные клетки, и исключить любые оставшиеся естественные клетки-убийцы и нейтрофилы.
Выберите закрытые ячейки и отобразить положительные ячейки HLA-DR на графике CD14/HLA-DR, используя меню высадки для выбора параметров. Нажмите на полигон ворот, и сделать ворота, чтобы исключить HLA-DR высокой / CD14 низких клеток B. Выберите закрытые ячейки и используйте меню высадки, чтобы отобразить их на сюжете CD16/CD14.
Из вариантов участка выберите участок зебры, который позволит сделать подсеть моноцитов воротами, чтобы определить пропорции подмножества. Теперь нажмите на прямоугольный значок ворот и выберите классические моноциты, нарисовав приблизительные прямоугольные ворота вокруг низкой популяции моноцитов CD14 high/CD16. Под дисплеем выберите, покажите медианы, чтобы отобразить среднюю интенсивность флуоресценции для классических моноцитов.
Отрегулируйте ворота таким образом, чтобы население имеет равное распределение от медианы слева и справа, и охватывает все ячейки влево. Выберите промежуточную популяцию, нарисовав прямоугольные ворота, которые охватывают ячейки справа от классических ворот. Отрегулируйте дно ворот, чтобы исключить неклассические клетки, выравнивая ворота с нижней частью концентрических кругов, которые полностью находятся в пределах классических моноцитных ворот.
Ворота неклассических подмножество, рисуя прямоугольную коробку вниз от нижнего края промежуточного подмножества, выбрав все клетки в нижней части населения. Под дисплеем выберите, покажите частоты ворот, чтобы определить процент каждого подмножества моноцитов. Наконец, выберите клетки из каждого подмножества моноцитов.
Измените параметры падения, чтобы создать гистограмму для каждого подмножества моноцитов, отображая каждый маркер. Затем вычислите степень выражения, используя среднее или геометрическое среднее значение, описанное в текстовом протоколе. Успешно закрытые популяции моноцитов показаны здесь.
И пропорции в соответствии с теми, в литературе. Пропорции для этой выборки были рассчитаны как, 88.1%классический, 4.33%промежуточные и 7.49%non-classical. Оценивая относительное положение других популяций, ясно, что Т-клетки и нейтрофилов, показанные здесь синим цветом, следуют далеко за пределами моноцита, перевернутой формы l, на участке CD16/CD14.
Однако и естественные клетки-убийцы, и популяции В-клеток, показанные здесь синим цветом, пересекаются с неклассической популяцией моноцитов. Тепловые карты, подтверждающие, что загрязняющие типы клеток были удалены, показаны здесь. Естественные клетки-убийцы были закрыты шагом HLA-DR CD16, в то время как В-клетки были закрыты шагом HLA-DR CD/14.
Здесь показано выражение маркеров M1 и M2 синим цветом по отношению к их управлению изотипом красным цветом. CD120b маркер M1, показывает четкий сдвиг выше его управления изотипом, для всех подмножеб моноцитов. Это также имеет место для CD93 M2 маркер, с выражением выше в классическом, умеренный на промежуточных и низкий на неклассических.
При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы загрязняющие клетки закрыты, так как они могут в противном случае способствовать количественного выражения. После этой процедуры могут быть изучены другие маркеры. Для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как, как моноцит маркер выражение изменения в болезни.
Не забывайте, что работа с человеческой кровью и формальдегидом может быть опасной, и поэтому меры предосторожности, такие как, средства индивидуальной защиты, и с использованием биоопасного капюшона, всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
