Основная цель этого эксперимента заключается в том, чтобы описать лапароскопической процедуры переноса эмбрионов в кролика в качестве модели. Основным преимуществом этой техники является то, что этот работает для переноса эмбрионов с помощью простой, минимально инвазивной техники. Кроме того, описанный здесь эффективный протокол криоконсервации эмбрионов также работает над долгосрочным хранением эмбрионов кролика, обеспечивая гибкие по времени логистические возможности и способность транспортировать образец.
Как мы знаем, вспомогательные репродуктивные технологии находятся в постоянной оценке для улучшения результатов и снижения связанных с этим рисков. Таким образом, используя оба метода, кролик может быть использован в качестве идеальной модели воспроизводства животных, чтобы ответить на ключевые вопросы в этой области, такие как последствия манипуляции эмбриона in vitro на потомство. Визуальная демонстрация этих вопросов имеет решающее значение, поскольку шаги по переносу эмбриона трудно узнать, потому что это должно быть сделано с большой точностью, чтобы обеспечить успех техники.
Для эмбриональной витрификации погрузите эмбрионы в эквилибирующий раствор на две минуты, а затем одну минуту инкубации в растворе витрификации. В конце инкубации загрузите эмбрионы в 125 микролитровых пластиковых мини-соломы, и пара закрытый конец мини-соломы с соответствующим один миллилитр микродиспенсера. Аспират базовой среды до одной трети длины соломы, а затем небольшой пузырь воздуха.
Далее используйте стереомикроскоп для аспирации эмбрионов в 40 микролитров раствора витрификации, а затем еще один небольшой пузырь воздуха и достаточно базовой среды, чтобы переместить первую жидкую фракцию до хлопка мини-соломы. Затем закройте открытый конец мини-соломы соломенной вилкой, окуните мини-солому прямо в жидкий азот для достижения витрификации и храните мини-солому в жидком азотном деваре. Чтобы разморозить эмбрионы для переноса, поместите мини-солому горизонтально на 10 сантиметров от жидкого пара азота на 20-30 секунд.
Когда процесс кристаллизации начнется внутри мини-соломы, погрузите мини-солому в водяную баню 25 градусов по Цельсию в течение 10-15 секунд. Немедленно удалите мини-солому и хлопчатобумажные пробки и используйте соединенный микродиспенсер, чтобы изгнать содержимое мини-соломы в тарелку, содержащую 25 градусов по Цельсию базовой среды, дополненной раствором 0,33 мохлорной сахарозы, в котором эмбрионы должны оставаться в течение пяти минут. Затем перенесите эмбрионы в тарелку свежей базовой среды еще на пять минут инкубации.
Как много дней раньше, как возраст эмбрионов, которые будут переданы, наблюдать тургидность и цвет вульвы доступных сексуально зрелых 4,5 месяцев самки кроликов, и вызвать овуляцию у восприимчивых животных с одной внутримышечной инъекции одного микрограмма ацетата buserelin независимо от массы тела. В день передачи, промыть свежие или оттаяли эмбрионов в 37 градусов по Цельсию базовой среды под стереомикроскопом, и прикрепить надлежащим образом настроенный 17-калибровочный эпидуральный катетер на один миллилитр шприц. Аспирировать один сантиметр базовой среды в катетер, а затем небольшой пузырь воздуха.
Затем аспирировать пять-семь эмбрионов и 10 микролитров базовой среды, а затем еще один небольшой пузырь воздуха, и последний один сантиметр базовой среды. После того, как эмбрионы были загружены, поместите анестезировал кролика-реципиента в клетку на стадии потепления, и применить мазь к глазам животного. После подтверждения отсутствия реакции на педаль рефлекс, брить мех из брюшной полости, очистить хирургическую область с хлоргексидин глюконат мыла, и удалить все оставшиеся волосы.
Обложка области с стерильной драпировки с отверстием для хирургической области, и вставить один эндоскопический трокар пять сантиметров в брюшную полость, два сантиметра caudal к процессу zyphoid, и использовать давление, регулирующее механический insufflator надуть брюшной полости. Вставьте эндоскопическую камеру через эндоскопический трокар и вставьте эпидуральную иглу 17-го калибра в паховую область, в двух-трех сантиметрах от индуфибулума. Вставьте загруженный катетер через эпидуральную иглу в брюшную полость и вставьте от одного до двух сантиметров эпидурального катетера через индуфибулум в ампуле.
Аккуратно угнетайте катетерный поршень, чтобы выпустить эмбрионы в яйцеклетку. Оба пузырька воздуха должны выйти из катетера. Удалите катетер сразу после того, как эмбрионы были освобождены, и аспирировать и освободить оставшуюся среду, чтобы подтвердить отсутствие эмбрионов.
После подтверждения успешной передачи эмбрионов, удалить эпидуральную иглу и эндоскоп камеры, и освободить брюшной углекислый газ через эндоскопический трокар. Очистите разрез трокара раствором хлоргексидина и закройте рану микронизым алюминием и пластиковой заправкой. Затем лечить животное с соответствующими антибиотиками и анальгетиками, и контролировать животное до полного выздоровления.
Минимально инвазивная лапароскопическая передача эмбрионов ставит кролика в число лучших моделей животных для репродуктивных исследований, с высоким процентом перенесенных свежих эмбрионов, в результате чего щенок. Примечательно, что более высокие значения достигаются, когда передача свежего эмбриона осуществляется с эмбрионами в ранней или компактной стадии морулы. Аналогичные результаты наблюдаются после ранней и уплотненной vitrified кролика морула передачи, особенно с компактными morulae, подтверждающие эффективность и надежность этого метода для передачи свежих в витрифицированных эмбрионов у кроликов.
После этой процедуры, другие методы, такие как условные вспомогательные репродуктивные технологии могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, как, как добавление плотности может понести в обезболивающее действие в более позднем возрасте. После недавних разработок, этот метод прокладывает путь для ученых в области воспроизводства, чтобы исследовать этот эффект у людей на основе близкого филогенетического расстояния между кроликом и людьми. Таким образом, этот метод может обеспечить результаты легко передаются в клиническую медицину человека, а также в других видах млекопитающих.
Не забывайте, что наш метод предлагает некоторые гигиенические и экономические преимущества, соответствующие концепции трех R благополучия животных, замена, сокращение и уточнение, намереваясь целью улучшения человеческого лечения экспериментальных животных.
