Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в биотехнологических и биомедицинских областях, таких как молекулярная основа варбурга и эффекты Крабтри. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет высокой пропускной способностью изучать влияние определенных веществ на респираторный и ферментативный обмен веществ. Начните с инокуляции 15-миллилитровой конической трубки, содержащей три миллилитра холодных, стерильных 2%дрожжевых экстрактов пептон-декстрозы, или бульона YPD, с 250 микролитров дрожжевых клеток S.cerevisiae, сохранившихся в глицероле при отрицательном 20 градусах цельсия.
Инкубировать дрожжи на ночь в орбитальном шейкере при 30 градусах по Цельсию и 200 об/мин. для полос на 60-миллилитр, 2%YPD агар заполненные Петри блюдо на следующее утро. Культура блюдо при 30 градусов по Цельсию, пока изолированные колонии наблюдаются.
Затем привить одну изолированную колонию в новой конической трубке, содержащей 10 миллилитров прохладного, стерильного 2%YPD бульона для ночной культуры при 30 градусах по Цельсию со тряской. Для установки микропластицы роста-кривой, добавьте 145 микролитров соответствующей экспериментальной культурной среды к каждой колодец стерильной микроплоциты 10 на 10 с крышкой и привить каждый колодец с пятью микролитров ночной культуры. Затем инкубировать многоясную пластину в считыватель микроплатформы при 30 градусах по Цельсию с постоянным возбуждением при 200 об/мин в течение 48 часов, измеряя оптическую плотность на 600 нанометров каждые 30 или 60 минут.
Для встряхивания конической колбы роста кривой установки, привить 20 миллилитров конической колбы, содержащие 4,8 миллилитров соответствующих стерильных средств культуры с 200 микролитров доинокулум культуры на 600 нанометров оптической плотности два для инкубации при 30 градусов по Цельсию и 250 об / мин. Агитация на 250 оборотов в минуту имеет решающее значение для достижения подходящего роста в низких концентрациях источников углерода, которые оказывают респираторный рост, как мы наблюдали снижение роста дрожжей в респираторных условиях на более низких скоростях возбуждения. Чтобы обеспечить измерение оптической плотности на 600 нанометров каждые два часа в течение 24 часов, разбавить 100 микролитров встряхиваемой конической культуры колбы в 900 микролитров дистиллированной воды в одноми миллилитровом спектрофотометре и аккуратно перемешать пипеткой.
Для обработки данных в соответствующем программном обеспечении статистического пакета создайте новый файл проекта, откройте новую таблицу и меню графиков и выберите XY. В меню выборочных данных выберите начало с пустой таблицы данных и точек и соединительной линии графика. Оставьте раздел X невыбранным в подколумнах для репликаций или значений ошибок. В разделе Y выберите введите 10 значений репликации в побочных подколумнах, а также среднее и ошибка участка SD. Затем нажмите создать.
Введите время получения измерений OD в столбце X и значений OD, полученных из культур в колонке Y. Чтобы определить экспоненциальную фазу роста, трансформируемую данными столбца Y в логаритмы, нажмите на анализ и выберите анализ преобразования. Используйте Y равно журнал Y, чтобы выбрать значения Y и открыть галерею результатов.
Выберите таблицу данных преобразования, нажмите анализ и выберите линейный анализ регрессии, исключая оптические значения плотности, которые не следуют линейному тренду, выбрав значения в таблице и угнетая контроль и E.In галерею таблиц данных, выберите данные одной таблице и нажмите анализ. Выберите нелинейную кривую регрессии, пригодную для анализа, и наборы данных для анализа и нажмите OK. Затем примените наименее квадраты, подходящие для данных, оставив раздел интерполята неизбранным, и нажмите OK. Затем откройте новый файл проекта, а в новом меню таблицы и графика выберите выбор столбца, начните с пустой таблицы данных и желаемого графика. Установите график, чтобы построить среднее со стандартным отклонением, и нажмите создать.
Скопировать среднее или дельта-значения времени из нелинейной таблицы результатов в галерее результатов и вставить данные в столбец. Наконец, нажмите проанализировать и выбрать анализ интереса в меню анализа столбца для сравнения кинетических параметров различных питательных условий. Значения кинетического порога роста различаются между сильными сторонами и должны оцениваться в соответствии с условиями, которые мы используем в анализе.
Культуры, демонстрирующие ферментативный фенотип, имеют небольшую фазу отставания и экспоненциальную фазу с высокими темпами роста. Культуры, которые получают энергию главным образом путем окислительного фосфорилирования, демонстрируют более длинную фазу отставания с медленными темпами роста в экспоненциальной фазе. Расчет конкретных темпов роста и удвоения времени кривых роста с использованием экспоненциального уравнения роста позволяет установить пороговые значения для респираторных и ферментативных значений роста.
Например, в этих репрезентативных экспериментах, влияние различных концентраций ресвератрола на S.cerevisiae BY4742 клетки показывают изменение энергетического статуса клетки в ответ на различные концентрации глюкозы. Здесь, добавки с 10%глюкозы показывает, что более низкие концентрации аммония пользу ферментативного метаболизма, о чем свидетельствует расширенная экспоненциальная фаза роста в этих культурах, в то время как более высокая концентрация вызывает респиро-ферментативный метаболизм, о чем свидетельствует расширенный этап отставания и более медленные темпы роста в течение экспоненциальной фазы. Наконец, между этими двумя различными штаммами дрожжей, выращенными в одинаковых условиях, наблюдаются устойчивые различия в ферментативных значениях времени удвоения, что подчеркивает необходимость проверки порога удвоения времени для каждого анализируемого штамма.
При попытке этой процедуры, важно помнить, что этот протокол используется только для проверки фенотипа. Специфическое воздействие на дыхание и брожение должно быть подтверждено анализами потребления кислорода или накоплением побочных продуктов брожения соответственно.
