Этот метод может помочь ответить на некоторые важные вопросы в области производства био-процессов в отношении аспектов характеристики клеточной линии и посредников и оптимизации процессов. Преимущества этого метода в том, что он обеспечивает больший контроль в колбы встряхивания и позволяет автоматизации и производительности большого количества небольших исследований масштаба для быстрого генерации данных. Демонстрация процедуры будет, Сай Рашмика Velugula и Кейси Kohnhorst, научные сотрудники в моей лаборатории.
Начните с погружения запас мерзкий в три раза от 10 до седьмого показать клетки на миллилитр замораживания среды в 37 градусов по Цельсию водяной бане. Когда останется лишь небольшая щепка льда, аккуратно размороженная быстро размороженные клеточные суспензии несколько раз и перенесите один миллилитр клеток в стерильную 125 миллилитровую вентилируемую колбу встряхивания, содержащую 29 миллилитров среды OptiCHO. Поместите колбу в инкубатор клеточной культуры при 37 градусах цельсия и 8%CO2 с встряхивания 130 об/мин.
Субкулирование клеток после 72 часов в 100 миллилитров свежих 37 градусов по Цельсию среды в 125 миллилитров спиннер колбу еще 72 часа инкубации при 37 градусов по Цельсию и 8%CO2 с перемешиванием при 70 об/мин. На третий день субкультуры, добавить свежие предварительно разогретой среды спиннер колбу для поддержания клеток, по крайней мере 90%жизнеспособности в течение последних 24 часов культуры. На следующее утро нажмите на значок удаленного рабочего стола и нажмите кнопку connect.
При подключении удаленного рабочего стола откройте программное обеспечение для счетчика ячеек и установите новый Reagent Pak. Затем опорожните отходы Trypan Blue и заготовьте систему. Далее минимизируйте удаленное соединение и откройте программное обеспечение микро биореа реакторов, используя существующий эксперимент в качестве шаблона для создания нового эксперимента.
Перед запуском определите пластины, используемые во время бега в мимической части программного обеспечения, и поместите 12 стерильных культурных сосудов в каждую культурную станцию. Поместите автоматические зажимные пластины поверх сосудов и поместите пластины для перемешивания поверх пластин зажима, убедившись, что каждый штифт надежно вставлен. Затем закретув зажим пластины с винтами и nobs при условии.
Для запуска системы сканируйте штрих-код, предоставляемый каждым культурным сосудом. Система будет инициализировать и проверять наличие соответствующих судов. Установите контроль температуры до 37 градусов по Цельсию и помешивая до 1000 об/мин и включите растворенный кислородный монитор PH.
Далее выполните программу средней зарядки. Когда все среды были загружены, 35 микролитров EX-CELL Antifoam будут добавлены из пластины Antifoam к культурным сосудам. После 30 минут начать запись растворенного кислорода и PH в средствах массовой информации культуры, что позволяет растворенного кислорода для достижения точки 50%После растворения кислорода равновесия, включите фоновую базу дополнений для достижения установленного PH 7,1 для всех культурных сосудов.
На следующее утро выполните приостановленный шаг PH и перенесите все содержимое колбы спиннера в стерильную 250-миллилитровую коническую трубку для центрифугации. Resuspend гранулы в достаточно свежей среде, что окончательная плотность будет один раз от 10 до шестого CHO клеток на миллилитр после добавления инокулума в культуре судов и добавить приостановленные клетки в соответствующие скважины стерильных крышкой 24 хорошо пластины. Добавьте три миллилитров инокулума к каждому хорошо и поместите инокулум пластины на назначенный стол внутри капота.
Затем, пусть культуры судов equilibrate, по крайней мере час и инициировать пять EX-CELL рассчитывать шаг в программе. Для ежедневного анализа питательных веществ и метаболита на второй день поместите пластины держателя образца трубки на назначенные палубы и загрузите открытые микроцентрифуговые трубки в соответствующие держатели. Затем поместите образцы в лоток анализатора, чтобы выполнить анализ питательных веществ.
Для прекращения пробега сначала выключите контроль температуры, за которым последует агитация. Остановите растворенный кислород PH управления и фоновой базы дополнений, все другие элементы управления, и монитор системы. Отвинтить зажим и перемешать пластины, удалить культуры судов, и винт сушки пластин в культуру станции.
Затем выполните двухчасовой цикл сушки по программе; нажмите стоп в программном обеспечении биореактора после завершения цикла сушки. Для сбора клеток передача жидкости клеточной культуры из реакторных сосудов в соответствующие конические трубки для центрифугации и фильтрации супернатантов через стерильные 0,22 микрометровые фильтры PVDH. Затем перенесите один миллилитр каждой стерильной клеточной культуры супернатанта в отдельные 1,5 миллилитровые микроцентрифуговые трубки для отрицательного хранения 20 градусов по Цельсию до анализа титера.
Для измерения IgG титеры образцов, сначала включите биосенсорную систему белковой помощи. После того, как лампа прогреется, по крайней мере один час, позволяют образцам равномерно до комнатной температуры и presoak один кончик белковой помощи на образец в свежей среде клеток, по крайней мере 30 минут. Затем установите температуру пластины до 26 градусов по Цельсию.
Загрузите образцы в систему и запустите анализ, используя анализ высокой чувствительности по умолчанию с регенерацией программного обеспечения для сбора данных. Используя интегрированный счетчик клеток, средняя плотность клеток и viabilities можно получить ежедневно для всех условий культуры. Используя анализатор питательных веществ, мы также можем получить профили питательных веществ и побочных продуктов, демонстрирующие целесообразность мониторинга этих атрибутов в системе реактора микробио.
Кроме того, общая продуктивность клеточных культур в различных культурных условиях, представляющих интерес, может быть количественно определена с помощью биосенсорной системы белковой помощи, как это было продемонстрировано. При попытке этой процедуры важно помнить, что протокол работает только в том случае, если программирование выполнено правильно; обеспечение своевременного выполнения протокольных шагов с минимальными ошибками. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как: жидкая хроматография, масс-спектрометрия и рассеяние многоугольного света, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся физических и химических свойств производимого продукта.
