Bu yöntem, hücre hattı karakterizasyonu ve arabuluculuk ve süreç optimizasyonu yönleri ile ilgili Bio proses üretim alanında bazı önemli soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin avantajları, sallama şişelerinde daha fazla kontrol sağlaması ve hızlı veri üretimi için çok sayıda küçük ölçekli çalışmanın otomasyona ve performansa olanak sağlamasıdır. Prosedürü gösteren, Sai Rashmika Velugula ve Casey Kohnhorst, benim laboratuvarda araştırma görevlisi olacak.
37 derece santigrat su banyosunda dondurucu ortamın mililitre başına 7.gösteri hücrelerine üç kez 10'luk bir hisse senedi pisliği batırarak başlayın. Sadece küçük bir buz parçası kaldığında, hızla çözülmüş hücre süspansiyonuna birkaç kez boru tonu ekleyin ve bir mililitre hücreyi 29 mililitre OptiCHO ortamı içeren steril 125 mililitrelik havalandırmalı sallama şişesine aktarın. Şişeyi 37 santigrat derece ve %8 CO2'de bir hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin ve 130 RPM sallayarak.
100 mililitre taze 37 santigrat derecede 72 saat sonra hücreleri subculturing bir 125 mililitre spinner şişesi başka bir 72 saat kuluçka için 37 derece santigrat ve 8% CO2 70 RPM de karıştırma ile. Alt kültürün üçüncü gününde, son 24 saatlik kültür için hücreleri en az %90 canlılıkta tutmak için spinner şişesine önceden ısıtılmış taze ortam ekleyin. Ertesi sabah, uzak masaüstü simgesine tıklayın ve bağlan'ı tıklatın.
Uzak masaüstü bağlı olduğunda, hücre sayacı yazılımını açın ve yeni bir Reagent Pak yükleyin. Sonra, Trypan Mavi atık boş ve sistem asal. Ardından, uzak bağlantıyı en aza indirin ve yeni bir deneme oluşturmak için mevcut bir denemeyi şablon olarak kullanarak mikro biyo reaktör yazılımını açın.
Koşmaya başlamadan önce, yazılımın taklit bölümünde çalışma sırasında kullanılan plakaları tanımlayın ve her kültür istasyonuna 12 steril kültür gemisi yerleştirin. Otoklavlı kelepçe plakalarını damarların üzerine yerleştirin ve karıştırma plakalarını her bir pimin güvenli bir şekilde takılı olduğundan emin olmak için kelepçe plakalarının üzerine yerleştirin. Daha sonra, kelepçe plakalarını verilen vida ve nob'larla sabitlayın.
Sistemi başlatmak için her kültür gemisi ile sağlanan barkod taz. Sistem, uygun gemilerin varlığını niçin önleyecek ve kontrol edecektir. Sıcaklık kontrolünü 37 dereceye, karıştırmayı da 1.000 RPM'ye ayarlayın ve çözünmüş oksijen PH monitörünü açın.
Ardından, orta şarj programını çalıştırın. Tüm ortam yüklendiğinde, Antiköpük plakadan kültür damarlarına 35 mikrolitre EX-CELL Antifoam eklenecektir. 30 dakika sonra çözünmüş oksijen ve PH kültür medya içinde kayıt başlar, çözünmüş oksijen% 50 bir setpoint ulaşmak için izin çözünmüş oksijen dengesonra, tüm kültür damarları için 7.1 ph setpoint ulaşmak için arka plan baz eklemeler açın.
Ertesi sabah, duraklatılmış PH adımını uygulayın ve spinner şişesinin tüm içeriğini santrifüj için steril 250 mililitrelik konik tüpe aktarın. Son yoğunluğu kültür damarlarına inokül ekledikten sonra mililitre başına altıncı CHO hücreleri bir kez 10 olacak yeterli taze ortamda pelet resuspend ve steril kapaklı uygun kuyulara askıya hücreleri ekleyin 24 iyi plaka. Her kuyuya üç mililitre inokül ekleyin ve kaputun içindeki belirlenen masaya inokül plakasını yerleştirin.
Daha sonra, kültür damarları en az bir saat boyunca denge ve programda beş EX-CELL sayısı adımı başlatın. Günlük besin ve metabolit analizi için ikinci gün örnek tüp tutucu plakaları belirlenen güvertelere yerleştirin ve açık mikrosantrifüj tüplerini uygun tutuculara yükleyin. Daha sonra, besin analizigerçekleştirmek için, analiz tepsisine örnekleri yerleştirin.
Çalıştırmayı sonlandırmak için ilk olarak sıcaklık kontrolünü kapatın ve ardından ajitasyon. Çözünmüş oksijen PH kontrolünü ve arka plan taban eklemelerini, diğer tüm kontrolleri ve sistem monitörünü durdurun. Kelepçeyi sökün ve plakaları karıştırın, kültür kaplarını çıkarın ve kurutma plakalarını kültür istasyonuna vidalayın.
Daha sonra, program üzerinde iki saatlik kurutma döngüsünü yürütmek;kurutma döngüsü bittikten sonra biyoreaktör yazılımında dur'a tıklayarak. Hücreleri hasat etmek için hücre kültürü sıvısını reaktör damarlarından santrifüj için ilgili konik tüplere aktarır ve süpernatantları steril 0,22 mikrometre PVDH filtreleri ile filtreler. Daha sonra, her steril hücre kültürünün bir mililitresini titre analizine kadar negatif 20 santigrat depolama için 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplere aktarın.
Örneklerin IgG titrelerini ölçmek için önce protein yardımı biyosensör sistemini açın. Lamba en az bir saat ısındıktan sonra, numunelerin oda sıcaklığına kadar dengede durmasını ve taze hücreli ortamda numune başına en az 30 dakika protein yardımı ucunu önceden emmesine izin verin. Daha sonra plaka sıcaklığını 26 dereceye ayarlayın.
Örnekleri sisteme yükleyin ve veri toplama yazılımında rejenerasyon la varsayılan yüksek duyarlılık testini kullanarak tayı çalıştırın. Entegre hücre sayacı kullanılarak, tüm kültür koşulları için her gün ortalama canlı hücre yoğunlukları ve uygunlukları elde edilebilir. Besin analizörünü kullanarak mikrobiyo reaktör sisteminde bu özellikleriizlemenin fizibilitesini gösteren besin ve yan ürün profillerini de elde edebiliriz.
Ayrıca, ilgi çeşitli kültür koşulları altında hücre kültürlerinin toplam verimlilik gösterildiği gibi protein yardımı biyosensör sistemi kullanılarak ölçülebilir. Bu yordamı denerken, protokolün yalnızca programlama doğru yapılırsa çalıştığını unutmamak önemlidir;protokol adımlarının en az hatayla zamanında yürütülmesini sağlamak gerekir. Bu prosedürün ardından üretilen ürünün fiziksel ve kimyasal özellikleri ile ilgili ek soruları cevaplamak için sıvı kromatografisi, kütle spektrometresi ve çok açılı ışık saçılımı gibi diğer yöntemler de yapılabilir.
