이 방법은 세포주 특성화 및 중재 및 공정 최적화의 양상에 관한 바이오 공정 제조 분야에서 중요한 질문 중 일부에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 쉐이크 플라스크에서 더 큰 제어를 제공하고 자동화및 빠른 데이터 생성을 위한 대규모 연구의 성능을 제공한다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 사이 라시미카 벨루굴라와 케이시 쿤호스트, 내 실험실에서 연구 동료가 될 것입니다.
37도 섭씨 수조에 있는 냉동 배지의 밀리리터 당 7번째 쇼 세포에 3배 10번의 스톡 을 담그는 것으로 시작합니다. 얼음의 작은 조각만 남아 있을 때, 부드럽게 빠르게 해동 된 세포 현탁액을 몇 번 파이프하고 OptiCHO 매체의 29 밀리리터를 포함하는 멸균 125 밀리리터 배출 쉐이크 플라스크로 세포의 1 밀리리터를 전송합니다. 플라스크를 세포 배양 인큐베이터에 37도, CO2는 8%로 놓고 130 RPM을 흔들어 놓습니다.
125 밀리리터 스피너 플라스크에서 신선한 섭씨 37도의 100밀리리터에서 72시간 후 세포를 섭씨 37도, 70RPM에서 교반하는 8%CO2의 또 다른 72시간 배양에 대한 소풍을 일으킨다. 서브컬쳐 의 셋째 날에, 마지막 24 시간 배양에 대한 적어도 90 %의 생존력으로 세포를 유지하기 위해 스피너 플라스크에 신선한 미리 따뜻해지는 배지를 추가하십시오. 다음 날에는 원격 데스크톱 아이콘을 클릭하고 연결을 클릭합니다.
원격 데스크톱이 연결되어 있을 때 셀 카운터 소프트웨어를 열고 새 시약 박을 설치합니다. 그런 다음 Trypan Blue 폐기물을 비우고 시스템을 프라임합니다. 다음으로, 원격 연결을 최소화하고 기존 실험을 템플릿으로 사용하여 마이크로 바이오 반응기 소프트웨어를 열어 새로운 실험을 만듭니다.
실행을 시작하기 전에 소프트웨어의 모방 섹션에서 실행하는 동안 사용되는 플레이트를 정의하고 각 배양 스테이션에 12 개의 멸균 배양 용기를 배치합니다. 오토클레이브 클램프 플레이트를 용기 위에 놓고 교반판을 클램프 플레이트 위에 놓고 각 핀이 단단히 삽입되도록 합니다. 그런 다음 클램프 플레이트를 나사와 노브로 고정합니다.
시스템을 시작하려면 각 배양 용기와 함께 제공되는 바코드를 스캔합니다. 시스템은 초기화하고 적절한 선박의 존재를 확인합니다. 온도 조절을 섭씨 37도로 설정하고 교반을 1, 000 RPM으로 설정하고 용존 산소 PH 모니터를 켭니다.
다음으로 중간 충전 프로그램을 실행합니다. 모든 배지가 적재되면, EX-CELL 안티폼의 35 마이크로리터가 항폼 플레이트에서 배양 용기에 첨가될 것이다. 30분 후 배양 매체 내에서 용존 산소 및 PH를 기록하기 시작하여 용존 산소가 용존 산소 평형 후 50%의 설정점에 도달할 수 있도록 모든 배양 용기에 대해 7.1의 PH 설정점을 획득한다.
다음 날 아침, 일시 중지 된 PH 단계를 실행하고 원심 분리를위한 멸균 250 밀리리터 원추형 튜브로 스피너 플라스크의 전체 내용을 전송합니다. 혈관에 접종을 첨가한 후 최종 밀도가 밀리리터당 제6 CHO 세포에 10배씩 될 정도로 신선한 배지에서 펠릿을 재연하고, 멸균 뚜껑24웰 플레이트의 적절한 우물에 부유세포를 첨가한다. 각 웰에 3 밀리리터의 접종을 추가하고 접종판을 후드 안에 지정된 책상에 놓습니다.
이어서, 배양용기가 적어도 한 시간 동안 평형화하고 프로그램에서 5개의 EX-CELL 카운트 단계를 개시하게 한다. 2일째에 매일 영양및 대사산물 분석을 위해 샘플 튜브 홀더 플레이트를 지정된 덱에 놓고 열린 마이크로센트심분리기 튜브를 적절한 홀더에 적재합니다. 이어서, 샘플을 분석기 트레이에 넣고 영양 분석을 수행한다.
실행을 종료하려면 먼저 동요 뒤에 온도 제어를 해제합니다. 용존 산소 PH 제어 및 배경 베이스 추가, 다른 모든 컨트롤 및 시스템 모니터를 중지합니다. 클램프를 풀고 접시를 저어 배양 용기를 제거하고 건조 판을 배양 소에 나사로 넣습니다.
그런 다음, 프로그램에 2 시간 건조 주기를 실행;건조 주기가 완료되면 생물 반응기 소프트웨어의 정지를 클릭. 세포를 수확하기 위해 반응기 용기로부터 세포 배양액을 원심분리를 위한 상응하는 원추형 튜브로 옮기고 멸균 0.22 마이크로미터 PVDH 필터를 통해 초중나티를 필터링한다. 이어서, 각 멸균 세포 배양의 1밀리리터를 개별 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 이송하여 음의 섭씨 20도 저장을 위한 테이터 분석까지.
시료의 IgG 티터를 측정하려면 먼저 단백질 보조 바이오센서 시스템을 켭니다. 램프가 적어도 1시간 동안 따뜻해진 후, 시료가 실온에 평형화되고 시료당 단백질 보조 팁 1개를 신선한 세포 배지에 30분 이상 미리 식힙니다. 그런 다음 플레이트 온도를 섭씨 26도로 설정합니다.
샘플을 시스템에 로드하고 데이터 수집 소프트웨어에서 재생하여 기본 고감도 분석서를 사용하여 분석체를 실행합니다. 통합 된 세포 카운터를 사용하여, 평균 실행 가능한 세포 밀도 및 비부채는 모든 배양 조건에 대해 매일 얻을 수 있습니다. 영양 분석기를 사용하면 미생물 반응기 시스템에서 이러한 특성을 모니터링할 수 있는 가능성을 보여주는 영양소 및 부산물 프로파일을 얻을 수 있습니다.
또한, 다양한 배양 조건 하에서 세포 배양물의 총 생산성은 입증된 바와 같이 단백질 보조 바이오센서 시스템을 이용하여 정량화될 수 있다. 이 절차를 시도하는 동안 프로토콜은 프로그래밍이 올바르게 수행되는 경우에만 작동하며 최소한의 오류로 프로토콜 단계를 적시에 실행해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 다각광 산란과 같은 다른 방법은 제조된 제품의 물리적 및 화학적 특성에 관한 추가 질문에 답하기 위해 수행될 수 있다.
