Este método puede ayudar a responder algunas de las preguntas importantes en el campo de la fabricación de procesos biológicos con respecto a los aspectos de la caracterización de la línea celular y la optimización media y de proceso. Las ventajas de esta técnica son que proporciona un mayor control en los matraces de agitación y permite la automatización y el rendimiento de un gran número de estudios a pequeña escala para la generación rápida de datos. Demostrando el procedimiento será, Sai Rashmika Velugula y Casey Kohnhorst, investigadores en mi laboratorio.
Comience sumergiendo una vil de stock de tres veces 10 a la séptima célula de la demostración por mililitro de medio de congelación en un baño de agua Celsius de 37 grados. Cuando sólo quede una pequeña astilla de hielo, entubar suavemente la suspensión celular descongelada rápidamente unas cuantas veces y transfiera un mililitro de células a un matraz de agitación estéril ventilado de 125 mililitros que contenga 29 mililitros de medio OptiCHO. Coloque el matraz en una incubadora de cultivo celular a 37 grados celsius y 8%CO2 con agitación de 130 RPM.
Subculturing the cells after 72 hours in 100 milliliters of fresh 37 degrees Celsius medium in a 125 milliter spinner flask for another 72 hour incubation at 37 degrees Celsius and 8%CO2 with stirring at 70 RPM. En el tercer día de subcultura, agregue un medio precalentó fresco al matraz de hilandero para mantener las células al menos un 90% de viabilidad durante las últimas 24 horas de cultivo. A la mañana siguiente, haga clic en el icono del escritorio remoto y haga clic en Conectar.
Cuando el escritorio remoto esté conectado, abra el software de contador de celdas e instale un nuevo Reagent Pak. A continuación, vacíe el residuo Trypan Blue y prepara el sistema. A continuación, minimice la conexión remota y abra el software del micro reactor biológico utilizando un experimento existente como plantilla para crear un nuevo experimento.
Antes de iniciar una carrera, defina las placas utilizadas durante la carrera en la sección de imitación del software y coloque 12 recipientes de cultivo estériles en cada estación de cultivo. Coloque las placas de sujeción autoclavedas en la parte superior de los recipientes y coloque las placas de agitación en la parte superior de las placas de sujeción asegurándose de que cada pasador esté bien insertado. A continuación, fije las placas de sujeción con los tornillos y los guiños proporcionados.
Para poner en marcha el sistema, escanee el código de barras proporcionado con cada recipiente de cultivo. El sistema inicializará y comprobará la presencia de los buques apropiados. Ajuste el control de temperatura a 37 grados centígrados y la agitación a 1.000 RPM y encienda el monitor PH de oxígeno disuelto.
A continuación, ejecute el programa de carga media. Una vez cargado todo el medio, se añadirán 35 microlitros de EX-CELL Antifoam desde la placa Antiesptilla a los recipientes de cultivo. Después de 30 minutos comenzar a registrar el oxígeno disuelto y PH dentro de los medios de cultivo, permitiendo que el oxígeno disuelto alcance un punto de consigna de 50%Después del equilibrio de oxígeno disuelto, gire las adiciones de base de fondo para alcanzar un punto de consigna PH de 7.1 para todos los recipientes de cultivo.
A la mañana siguiente, ejecute el paso PH pausado y transfiera todo el contenido del matraz spinner a un tubo cónico estéril de 250 mililitros para centrifugación. Resuspender el pellet en suficiente medio fresco como para que la densidad final sea de 10 veces a las sextas células CHO por mililitro después de añadir el inóculo a los recipientes de cultivo y añadir las células suspendidas en los pozos apropiados de una placa estéril de 24 pozos. Agregue tres mililitros de inóculo a cada pozo y coloque la placa de inóculo en el escritorio designado dentro de la capucha.
Luego, deje que los recipientes de cultivo se equilibren durante al menos una hora e inicien el paso de recuento de cinco EX-CELL en el programa. Para el análisis diario de nutrientes y metabolitos en el segundo día, coloque las placas del soporte del tubo de muestra en sus cubiertas designadas y cargue los tubos de microcentrífuga abiertos en los soportes apropiados. A continuación, coloque las muestras en la bandeja del analizador para realizar el análisis de nutrientes.
Para terminar la carrera primero apague el control de temperatura seguido de la agitación. Detenga el control PH de oxígeno disuelto y las adiciones de base de fondo, todos los demás controles y el monitor del sistema. Desenrosque la abrazadera y revuelva las placas, retire los recipientes de cultivo y atornille las placas de secado en la estación de cultivo.
A continuación, ejecute el ciclo de secado de dos horas en el programa;haciendo clic en detener en el software de biorreactor una vez que el ciclo de secado ha terminado. Para cosechar las células, transfiera el fluido de cultivo celular de los recipientes del reactor a los tubos cónicos correspondientes para la centrifugación y filtre los sobrenadantes a través de filtros estériles PVDH de 0,22 micrómetros. A continuación, transfiera un mililitro de cada sobrenadante de cultivo celular estéril a tubos de microcentrífuga individuales de 1,5 mililitros para un almacenamiento negativo de 20 grados centígrados hasta el análisis del título.
Para medir los títulos IgG de las muestras, primero encienda el sistema de biosensores de ayuda a proteínas. Después de que la lámpara se haya calentado durante al menos una hora, deje que las muestras se equilibren a temperatura ambiente y presoak una punta de ayuda a la proteína por muestra en medio de células frescas durante al menos 30 minutos. A continuación, ajuste la temperatura de la placa a 26 grados centígrados.
Cargue las muestras en el sistema y ejecute el ensayo utilizando el ensayo de alta sensibilidad predeterminado con la regeneración en el software de adquisición de datos. Usando el contador celular integrado, las densidades celulares y viabilidads medias viables se pueden obtener diariamente para todas las condiciones de cultivo. Utilizando el analizador de nutrientes también podemos obtener los perfiles de nutrientes y subproductos que demuestran la viabilidad de monitorear estos atributos en el sistema del reactor de microbio.
Además, la productividad total de los cultivos celulares en las diversas condiciones de cultivo de interés se puede cuantificar utilizando el sistema de biosensores de ayuda a proteínas como se ha demostrado. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el protocolo solo funciona si la programación se realiza correctamente;garantizando la ejecución oportuna de los pasos del protocolo con errores mínimos. Siguiendo este procedimiento se pueden realizar otros métodos como: cromatografía líquida, espectrometría de masas y dispersión de luz multiángulo para responder preguntas adicionales sobre las propiedades físicas y químicas del producto fabricado.
