Общая цель этого метода заключается в создании высокой ткани конкретных целевой системы выражения. В этом методе мы продемонстрировали генерацию двоичного транскрипционные драйвера, специфичные для нашего омолога Drosophila FGF, без разветвленной. Динамическое, спатиотемпоральное выражение безотвечных регулирует ветвовой гемогенез трахеального эпителия дыхательных путей.
Хотя этот метод может дать представление о спатиотемпоральной экспрессии и миграции неотвеки производящих клеток, он может быть легко применен к другим генам и тканям в Дрозофиле или в других модельных организмах, таких как C.Elegans и зебрафиш. Основным преимуществом этого метода является то, что он генерирует экспрессионные системы, которые являются высоко надежными, ткани и генные специфические, и активны исключительно в клетках, где цис нормативных элементов замененного гена являются функциональными. Бинарные транскрипционные системы являются важными инструментами для целевого экспрессии генов и манипуляций.
Транс-активатор, такой как GAL4 или LexA, выраженный под контролем регуляторных элементов гена cis, управляет транс-геном effector, который находится ниже по течению от определенных сайтов связывания транскрипции, таких как UAS для GAL4 и/или LexO для LexA. Эта методология заменяет первый экзон кодирования без разветвленного гена драйвером транскрипции. Метод НА основе CRISPR Cas9 помещает последовательность трансактиваторов LexA под эндогенную регуляции безотверхного гена и, следовательно, облегчает трансактиваторное выражение исключительно в безотекторных специфических spatiotemporal моделях.
Начните с выбора двух целевых объектов РНК руководства, которые конкретно нацелены на два конца выбранного района, представляющих интерес. Откройте инструмент дизайна CRISPR по выбору. Fly CRISPR Оптимальный целевой finder используется здесь.
Нажмите на Select Genome'insert последовательность интереса, и выберите самые последние загружены Drosophila меланогастер генома аннотации, в настоящее время R подчеркнуть шесть, в выпав меню. Далее нажмите Выберите руководство length'and ввода 20. Выберите все цели CRISPR и нажмите Найти цели CRISPR.
Оцените все цели руководства кандидата РНК, установив максимум для строгости и NGG only'for PAM. Для создания вектора экспрессии РНК-руководства тандема сначала ПЦР усиливает фрагмент ДНК, чтобы ввести две последовательности протокомеров в вектор экспрессии РНК pCFD4. Используйте перемотку вперед и обратно, каждый с прото-пространство последовательности, и перекрытия с pCFD4 вектор последовательности в ПЦР с использованием высокой точности полимеразы и pCFD4 шаблон ДНК.
Чтобы подготовить pCFD4 для клонирования, переварить плазмиду с ферментом Bbs1. Настройка реакции в соответствующем буфере пищеварения, содержащем от двух до пяти микрограммов плазмиды pCFD4 и одного микролитера фермента Bbs1 и конечного объема 50 микролитров. Смешайте содержимое реакции, нажав на трубку и собирая все рассеянные капли от стенки трубки до дна на короткий спин.
Инкубировать смесь реакции при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов после запуска продукта ПЦР и переварить плазмид на один процент агарозного геля. Очистить 6,4-килограммовую пару линейной плазмиды и 600 базовых пар pcR-продуктов с помощью стандартных столбцов для очистки геля. Настройка реакции сборки ДНК в соответствии с протоколом производителя.
Для геномного стука в gal4 или LexA последовательности, дизайн двухместный HDR донора, содержащего транс-активатор последовательности, в окружении двух гомологии оружия. Чтобы избежать повторной таргетинга направляющих РНК на проектируемый локус, разработать замену донора таким образом, чтобы направляющие рнк-сайты распознавания были нарушены введенной экзогенной последовательностью. Кроме того, чтобы избежать изменения чистоты регуляторных элементов cis, всегда выберите направляющие сайты распознавания РНК в регионе кодирования exon.
Для создания замены кассеты спланируйте стратегию сборки ДНК, чтобы объединить четыре сегмента вместе. Пять основных и три основных гомологических оружия, средняя экзогенная трансактиваторная последовательность ДНК и линейный вектор клонирования. ПЦР усиливают GAL4 или кассету выражения LexA из соответствующего вектора, а ПЦР усиливает гомологические руки из геномной ДНК, извлеченной из родительской линии мухи, выбранной для инъекций.
Используйте полимеразу высокой точности в каждом ПЦР для создания фрагментов цели. Чтобы настроить реакцию сборки ДНК, смешайте линейный вектор клонирования и целевые фрагменты, генерируемые клонированием ПЦР, с мастермиксом сборки ДНК и окончательным объемом реакции до 20 микролитров в соответствии с инструкциями производителя. Инкубировать смесь реакции в течение одного часа при 50 градусах по Цельсию.
Когда эмбрионы Nos-Cas9 ранее вводили как с руководством РНК выражение плазмидной и замены донора, развиваться во взрослых, крест G0 летит индивидуально, чтобы сбалансировать ваши мухи от линии, подходящей для целевого аллеля. Обезболивать потомство F1 с каждого креста G0 на панели двуокиси углерода. Случайно выберите от 10 до 20 самцов под стерео микроскопом.
Индивидуально пересекаем каждого выбранного самца к женщине-балансеру от линии, подходящей для целевого аллеля. Когда личинки F2 люк, выбрать F1 отца из каждого креста. Извлекайте геномную ДНК, хлюпая каждую муху в течение 10-15 секунд кончиком пипетки, содержащей 50 микролитров хлюпающих буферов без дозирования буфера.
Затем, обойтись оставшийся буфер в трубку и хорошо перемешать. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 20-30 минут. После инкубации поместите трубки в тепловой блок 95 градусов по Цельсию в течение одной-двух минут, чтобы инактивировать протеиназу K.After спиннинг вниз в течение пяти минут на 10000 раз G, хранить препарат на четыре градуса Цельсия для дальнейшего анализа ПЦР.
Выполните трехшаговую ПЦР-экраны с помощью грунтовки вперед один и обратно один на экран для существования вставки или замены. Выполните PCR, используя вперед два и обратное две грунтовки для проверки вставки или замены из трех основных области. Выполните PCR с помощью грунтовок M13F и обратного три, чтобы проверить концы-in'HDR.
Держите лету линий с подтвержденными ends-out'HDR и установить сбалансированные запасы от F2 поколения. Из-накрест балансер летит снова, чтобы удалить любые непреднамеренные мутации на других хромосомах. Ветвленое, или выражение bnl, показано здесь в красном цвете в третьем диске крыла личинок instar, с приемным дыханием выражая клетки, показанные в зеленом цвете, в растущем баке воздуха primordium.
Ячейки без разветвленной экспрессии показаны здесь, в поперечной соединительной ветви TR5 и спинной ветви TR2. Дыхание выражения трахеи клетки показаны здесь в зеленом цвете. Дыхательные экспресс-клетки показаны зеленым цветом, отмечая развивающаяся эмбриональная трахея от 9-го этапа до стадии 14, а ветвятные экспресс-клетки показаны красным цветом.
На этом изображении показано безотвечное выражение, индуцированное в местах эктопической ткани в гипоксических условиях, по отношению к контролю. Этот метод был разработан, чтобы сохранить все оригинальные spatiotemporal правила разветвленной транскрипции генов. Поэтому важно было заменить только первый экзон кодирования гена последовательностью трансактиватора LexA.
После своего развития, этот новый генетический инструментоильный инструмент проложил путь к изучению новых моделей экспрессии тканей без разветвленного гена. Это также позволило гена неправильной экспрессии и сбил исключительно в без разветвленной экспрессии клеток и помогли в мониторинге линейной миграции и сигнализации взаимодействия клеток.
