Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области токсикологии зародышей человека, такие как, как повреждения в геноме человеческих изначальных зародышевых клеток создаются или восстанавливаются. Основным преимуществом этого метода является то, что человеческие изначальные зародышевые клетки могут быть получены в течение двух недель из загрунтовых клеток pluripotency iPS, укрывающих предрасположенность к заболеваниям генетического фона. Последствия этого метода распространяются на профилактику геномных нарушений в клетках зародышевой клетки человека, потому что наша модель клеточной культуры может помочь нам уменьшить токсичность зародышевой терапевтического препарата.
Для начала с генерации человеческих изначальных зародышевых клеток, таких как клетки, или человеческие PGCLCs, подготовьте внеклеточные матричные белковые пластины и клеточную подвеску человеческих iPSCs, как описано в текстовом протоколе. Подготовь одноклеточную суспензию загрунтовых плюрипотентных человеческих iPSCs в среде mTeSR1, содержащей ингибитор КИНАзы Y-27632 Rho. Тщательно отрегулируйте плотность клеток до 100 000 клеток на миллилитр.
Прививают два миллилитров клеточной подвески загрунтовываемых человеческих iPSCs в каждом скважине внеклеточного матричного белка, покрытого шестью пластинами скважин, убедившись, что клетки равномерно распределены путем встряхивания пластин вертикально и горизонтально. Инкубировать пластины в трех газа CO2 инкубатор при 37 градусов по Цельсию. Очень важно привить ровно 200 000 клеток в каждом колодец из шести хорошо пластины.
Точный подсчет ячеек имеет решающее значение. После завершения переходного преобразования в наивную плюрипотенцию, клетки должны выглядеть более-слияние, что нормально. Точное время средних изменений имеет важное значение для достижения высоких человеческих PGCLCs и экспериментальной воспроизводимости.
Плотность культуры 4i hiPSC высока в этих условиях, и ожидается, что клетка станет стеченной через 48-72 часа после прививки. Через 24 часа после прививки измените среду двумя миллилитров на колодец среднего mTeSR1 без Y27632. Начните преобразование загрунтованной плюрипотентности состояния человека iPSCs в 4i наивные плюрипотентные стволовые клетки, путем потепления 50 миллилитров 4i полной среды в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 15 минут.
В 48 и 72 часов после прививки, удалить пластины из инкубатора, и изменить средний с 2 миллилитров на колодец 4i полной среде. Центрифуга моющего средства покрытием микроуровн пластины на 1000 г в течение пяти минут при комнатной температуре. Осмотрите скважины с перевернутым микроскопом, чтобы обеспечить отсутствие пузырьков воздуха.
Промыть скважины, как описано в текстовом протоколе, и повторить центрифугации. Добавьте 4i полную среду в промытые колодцы. Центрифуга пластины на 1000 г в течение пяти минут при комнатной температуре, и проверить скважины снова.
Чтобы привить 4i человеческих iPSCs в пластину микроуэлла, подготовить человека iPSC клеточной подвески, как описано в протоколе. Фильтр этой ячейки подвески через 40 микрометров пор размер клетки ситечко для удаления клеток агрегатов. Вымойте ситечко с одним миллилитров предварительно разогретой 4i полной среде три раза, чтобы собрать все клетки из ситечко, и рассчитывать клетки с культурой счетчика.
Затем разбавьте эту одноклеточную подвеску 4i наивных человеческих iPSCs до 27-32,4 миллиона клеток в 9 миллилитров предварительно разогретой 4i полной среды, содержащей Y27632. Удалите ранее подготовленную микроуровнную пластину, содержащую 1 миллилитр 4i полной среды на колодец, из трехсерийного инкубатора. Прививка 1 миллилитр 4i наивный человека iPSC подвески в каждой хорошо, для достижения концентрации от 3,0 до 3,6 миллиона клеток на колодец.
Аккуратно пипетки равномерно распределить клетки. Центрифуга пластины при температуре 100 г в течение 3 минут при комнатной температуре. Поместите пластину в трех-газовый инкубатор CO2, убедившись, что не беспокоить клетки гранулы в микроуэллах, и инкубировать в течение 24 до 30 часов, потому что ночь инкубации недостаточно для формирования жестких эмбриональных органов или EBs.
Довоенные 5 миллилитров человека PGCLC базальной среды и 20 миллилитров человека PGCLC полной среды, по крайней мере пять минут в 37 градусов по Цельсию водяной бане Осторожно место 40 микрометров поры размера клетки ситечко вверх дном над 50 миллилитров полипропиленовой конической трубки. Чтобы отделить EBs от микроуровн, аккуратно пипетки каждый колодец пластины. Чтобы удалить ячейки, не включенные в EB, фильтруйте содержимое всех скважин через ситечко клетки.
Аккуратно вымойте EBs, сохраненные на мембране клеточного ситечко с 1 миллилитр предварительно разогретой человеческой базальной среды PGCLC, и повторите мыть пять раз. Поместите свежую 50-миллилитровую коническую трубку на клеточный ситечко, так что клеточный ситечко теперь расположен с правой стороны вверх в новой трубке. Быстро инвертировать клеточный ситечко с новой трубкой, которая будет позиционировать EBs ниже мембраны клеточного ситечко.
Добавьте 18 миллилитров предварительно разогретой человеческой PGCLC полной среды к мембране клеточного ситечко для сбора EBs в конической трубке. Затем пластина 3 миллилитров на скважину подвески EBs в скважины низкого крепления шесть скважин пластины. Поместите тарелку на качели двигаться рокер в трех-газовый инкубатор, и тщательно установить скорость качания примерно на 20 поворотов в минуту.
На седьмой-13-й день эксперимента, только что подготовить 20 миллилитров человека PGCLC полной среде каждый день. Снимите пластину с рокера, что сделает EBs опускаться на дно скважин. Удалите старую среду без высыхания EBs так, что около 0,2 миллилитров старой среды остается в каждой хорошо.
Добавить 3 миллилитров на колодец свежего человека PGCLC полной среде, после удаления старой среде каждый день. Для идентификации человеческих PGCLCs как OCT4-положительных клеток, урожай EBs на 1,5 миллилитров низким содержанием связывания микроцентрифуг трубки. Пусть EBs опускаются на дно при комнатной температуре, и отказаться от среды.
Промыть EBs с ледяной 1X PBS. После удаления PBS, инкубировать EBs в 1 миллилитр ледяной 1%вес по объему натрия азида в PBS на льду в течение пяти минут. Пусть EBs опускаются на дно при комнатной температуре.
После отбрасывания супернатанта, промыть EBs с ледяной PBS. Оттепель 200 микролитров внеклеточного матричного белка на льду. Добавьте белок в трубку, содержащую EBs.
Оставьте трубку при комнатной температуре примерно на 10 минут, пока гель не затвердеет, и EBs встроены. Чтобы исправить EBs, добавить 1 миллилитр 4%формальдегида в PBS в трубку, и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут с нежным качания. После этого, отбросить формальдегид и промыть EBs один раз с ледяной PBS.
Добавьте 1 миллилитр из 70% этанола. Хранить в 70%ethanol при 4 градусах по Цельсию в течение одной недели, или приступить к обработке их со стандартным протоколом FFPE. Плотность клеток и равномерное распределение клеток на каждой колодец имеют решающее значение.
IPSCs человека в 2 миллилитров Y27632 дополнены среды на колодец из шести хорошо пластины, достичь 20 до 30% слияния после 24 часов. После дополнительной 24-часовой культуры в среде mTeSR1, в отсутствие Y27632, клетки агрегировали и сформировали колонии, занимая около 30% площади роста. После 24 часов культуры в 4i перепрограммирования среды, клетки достигли слияния.
После дополнительных 24 часов культуры в среде 4i, клетки стали более плотно упакованы. После 24-часовой инкубации в микроуровнах в 4i перепрограммирования среды, клетки сформировали EBs с их круговой контур видимый на 24 до 30 часов после прививки. EBs хранится в среде PGCLC человека, в качаниях неадхенерентных условиях, сохранили свою сферическую форму без агрегации после 24 часов.
После 192 часов, EBs были больше, сохраняя ту же морфологию. Через 5 дней клетки появились как OCT4, выражают клетки на поверхности EB, увеличивая их количество через 8 дней. Клетки из одноклеточной подвески человека PGCLCs были обогащены как CD38-положительных клеток FACS.
Клетки, которые не выражают CD38 были отрицательный контроль. Чтобы избежать загрязнения, ворота FACS CD38-положительные и CD38-отрицательные клетки были разделены с большим отрывом. При попытке этой процедуры, его важно следовать точному подсчету клеток и сроки средних изменений.
Опуская среднее изменение даже один день, или уменьшая объем этой среды на любом этапе, может привести к массовой гибели клеток. Скорость скасывания культуры эмбриональных тел должна быть тщательно оптимизирована.
