IPSC приматов полезны, но часто их трудно получить из-за этических и технических проблем. Этот протокол дает наиболее доступный путь к созданию и поддержанию IPSC приматов. Использование мочевыводящих клеток в качестве основного источника IPSC имеет большое преимущество, поскольку они могут быть получены совершенно неинвазивным способом без каких-либо специальных методов.
Продемонстрирует процедуру Джессика Радмер, аспирант из Wolfgang M.S.Laboratory. Для начала центрифугируйте пробирку, содержащую мочу, в 400 г в течение 10 минут. Затем тщательно аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя в пробирке примерно один миллилитр и ресуспендируйте в ней гранулу.
Промойте клетки, добавив 10 миллилитров буфера для промывания мочи, содержащего амфотерицин, и тщательно перемешайте суспензию с помощью серологической пипетки. После центрифугирования тщательно аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя в пробирке примерно менее 0,2 миллилитра. Ресуспендируют клеточную гранулу в одном миллилитре первичной среды мочи, содержащей амфотерицин, на 50 миллилитров первоначально обработанной мочи.
Удалите желатин и добавьте один миллилитр суспензии в лунку с желатиновым покрытием 12-луночную пластину. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа. Чтобы приготовить 12-луночную пластину с покрытием из матрицы фундаментальной мембраны, добавьте 500 микролитров матрицы базальной мембраны на лунку.
Переместите тарелку, чтобы распределить жидкость, и инкубируйте ее при температуре 37 градусов по Цельсию в течение одного часа. После инкубации замените матрицу базальной мембраны на 900 микролитров среды REMC и храните ее при температуре 37 градусов Цельсия до использования. Рассчитайте объем вирусов Сендая, необходимый для кратности заражения пятью, используя уравнение.
Быстро разморозьте компоненты комплекта для перепрограммирования Sendai на водяной бане, закаленной при температуре 37 градусов по Цельсию. Добавьте среду REMC в общей сложности 100 микролитров в пробирку перед добавлением рассчитанного объема вирусов Сендай и перемешиванием. После диссоциации мочевых клеток, как описано в рукописи, подсчитайте клетки с помощью счетчика клеток и перенесите желаемое количество клеток в пробирку объемом 1,5 миллилитра.
Получают гранулу центрифугированием и ресуспендируют ее в 100 микролитрах приготовленной смеси вирусов Сендая. Инкубируйте пробирку в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия для заражения суспензией. После инкубации добавьте REMC в общей сложности до одного миллилитра перед посевом клеточной суспензии в матрицу базальной мембраны, покрытую 12-луночной пластиной.
После трансдукции меняйте среду каждые вторые сутки до развития индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, или IPSC, колоний с переходом на среду генерации PSC на пятый день. Когда колонии IPSC вырастут достаточно большими для прохождения комков, аспирируйте среду из культивируемых клеток и тщательно промойте клетки 500 микролитрами DPBS. После удаления DPBS добавьте в лунку 500 микролитров 0,5 миллимолярной ЭДТА и инкубируйте в течение двух-пяти минут.
Внимательно наблюдайте за клетками под микроскопом, пока колонии не начнут отделяться. Когда края колоний начнут отслаиваться и станут видны промежутки между клетками, удалите ЭДТА и аккуратно добавьте 500 микролитров DPBS. Аспирируйте DPBS и промойте лунку 500 микролитрами питательной среды PSC с помощью пипетки P-1000.
Пипеткой вверх и вниз, чтобы разогнать колонии в комки соответствующего размера. В зависимости от слияния, желаемой плотности засеянных клеток и клональных предпочтений IPSC перенесите от 1/10 до 1/50 суспензии клеточного комка в новые лунки. Аккуратно переместите тарелку вперед и назад несколько раз, чтобы равномерно распределить комки в лунке.
Инкубируйте тарелку не менее 30 минут при температуре 37 градусов по Цельсию, чтобы комки прикрепились. Меняйте среду каждые два-три дня, пока колонии не станут достаточно большими для прохождения. После выделения можно увидеть плоскоклеточные клетки и различные более мелкие круглые клетки, которые выводятся с мочой.
Можно увидеть первые адгезивные пролиферирующие клетки, и эти клетки вырастают в большие колонии, которые можно пройти. Можно увидеть два различных типа клеток, один из которых имеет эпителиальный фенотип, а другой демонстрирует более мезенхимальный фенотип с удлиненной формой. После первого прохождения мочевые клетки растут монослоем.
Во время генерации IPSC можно увидеть некоторые адгезивные клетки, и эти клетки начинают проявлять морфологические изменения, указывающие на перепрограммирование клеток. Кроме того, клетки, которые образуют колонии, демонстрируют типичную морфологию эмбриональных стволовых клеток. Все сгенерированные IPSC имеют типичную морфологию колонии, подобную эмбриональным стволовым клеткам, характеризующуюся плотно упакованными клетками с четко очерченными краями.
Иммуноцитохимия была использована для проверки экспрессии маркеров, связанных с плюрипотентностью, в IPSC горилл. Более того, анализ проточной цитометрии показал, что проанализированные IPSC орангутанов положительны на TRA-1-60. Кроме того, IPSC горилл способны дифференцироваться на линии энтодермы, мезодермы и эктодермы.
Увеличение количества дифференцированных клеток и потеря целостности границ и однородности указывают на низкое качество IPSC. Напротив, четкие границы, плотная клеточная упаковка и выдающиеся ядрышки означают высокое качество IPSC. Из-за корональной изменчивости необходимо оптимизировать специфические условия клона, такие как коэффициент расщепления, время прохождения и размер скопления, чтобы сохранить IPSC приматов здоровыми.
В качестве контроля качества установленных IPSC можно проверить предпотенцию путем прямой или косвенной индукции дифференцировки, такой как дифференцировка in vitro EV, помимо проверки экспрессии маркерных генов.
