Этот анализ был разработан для решения ключевых вопросов в области биологии плазменной мембраны и для установления того, насколько эффективно поврежденные клетки могут запечатать свою плазменную мембрану. Этот метод может быть использован для измерения эффективности перепечатывания плазменной мембраны в высокой пропускной способности и выявления конкретных белков и соответствующих путей, которые являются посредниками плазменной мембраны повторного пропечатки. Начните с добавления 20 миллилитров 2,5 раза 10 до пятого HeLa клеток на миллилитр роста средней подвески в стерильный бассейн пипетки и использовать 10 миллилитров серологической пипетки тщательно перемешать клетки.
Далее, используйте многоканальный микропипют, чтобы посеять 100 микролитров клеток на колодец в тройном в 96-ну плоский, ясное дно, черный полистирол ткани культуры обработанной пластины. Помните, что однородное распределение клеток является ключом к успешному эксперименту, так как сравнение всех экспериментальных условий требует эквивалентного подсчета клеток. После 24 часов в инкубаторе увлажненной культуры клеток при 37 градусах Цельсия и 5%CO2, довоенной считыватель пластины до 37 градусов по Цельсию и установить оптическую конфигурацию монохроматора, режим чтения на флуоресценцию, и тип чтения кинетической.
В настройках длины волны выберите девять нанометров и 15-нанометровый диапазон выбросов. Для анализа с использованием йодида пропидия установите возбуждение и выброс длин волн до 535 нанометров и 617 нанометров, соответственно. Под типом пластины выберите 96 скважин для формата пластины и выберите предустановленную конфигурацию пластины, соответствующую черной стене ясной нижней пластины.
Под областью чтения, выделить скважины, которые будут проанализированы на протяжении всего кинетического анализа. Под PMT и оптикой, предустановить вспышки на чтение до шести и проверить поле для чтения снизу. В соответствии со временем введите ноль часов 30 минут и ноль секунд в общее время времени времени 30 минут кинетического анализа и введите ноль часов пять минут и ноль секунд для интервала.
Подтвердите указанные настройки в информации о настройках и нажмите OK. Затем нажмите кнопку "Читать", чтобы инициировать кинетический запуск. Чтобы установить параметры изображения в режиме настройки, установите MiniMax для оптической конфигурации, визуализации режима чтения и конечной точки для типа чтения. Под длинами волн выберите передаваемый свет и соответствующие коробки флуоресценции, соответствующие экспериментальным возбудимым и эмиссионным длинам волн.
Установите тип пластины и область чтения, как только что продемонстрировано, и под настройками области хорошо, установите количество сайтов в пределах хорошо, которые будут изображены. В настройках приобретения изображения для GFP установите устройство для изображения всего колодец со временем экспозиции 20 миллисекунд на изображение. Для передаваемого света приобретайте одно изображение центра каждой системы с восьмимисекундным временем экспозиции.
Для йодида пропидия, приобрести одно изображение в центре каждой хорошо с 20 миллисекундного времени экспозиции. Затем подтвердите настройки в информации о настройках и нажмите OK и прочитайте, чтобы инициировать визуализацию. Для установки высокопротезной флуоресценции на основе анализа для ремонта разрешительных условий, мыть клетки два раза с 200 микролитров 37 градусов по Цельсию M1 среды на колодец и добавить 100 микролитров свежих 37 градусов по Цельсию M1 среды дополнен 30 микромолярный иодид пропидия после отказа от второй стирки.
Для ремонта ограничительных условий, мыть клетки один раз с 200 микролитров 37 градусов по Цельсию M2 среды дополняется пятью миллимолярной EGTA на хорошо следуют одна стирка с 200 микролитров M2 среды в одиночку. После отбрасывания второй стирки добавьте 100 микролитров свежего 37-градусного среднего цельсия M2, дополненного 30 микромолярной йодидом пропидия на колодец. Затем изображение пластины под передаваемым светом, GFP и PI, как только что продемонстрировано.
В то время как пластина в настоящее время изображены, место 96 хорошо круглые нижней полипропиленовой микроплеи на льду и настроить пластину, как только что продемонстрировано для предыдущей пластины. Для ремонта разрешительных условий добавьте 100 микролитров ледяной M1 среды, дополненной 60 микромолярный йодидный йодид на колодец с последующим добавлением 100 микролитров ледяного M1 с или без 4X listeriolysin O на колодец. Для ремонта ограничительных условий добавьте 100 микролитров ледяной M2 среды, дополненной 60 микромолярный йодидный иодид на колодец с последующим добавлением 100 микролитров ледяного M2 с или без 4X listeriolysin O на колодец.
Необходимо подготовить листериолизин O при соответствующей экспериментальной концентрации на льду примерно за пять минут до начала кинетического анализа, когда плита одна находится на льду, а плита 2 готовится. Когда первая пластина будет закончена визуализации, немедленно передать пластину на лист алюминиевой фольги на льду. Через пять минут, передача 100 микролитров из каждого колодец второй пластины в соответствующие хорошо в первой охлажденной пластины, вставив пипетки советы ниже мениска раствора в каждом задолго до выброса объема без смешивания для правильного распределения токсина.
Разрешить токсин связываться с клетками-хозяинами в течение одной минуты и немедленно передать первую пластину на считыватель пластин для пост-кинетического анализа с помощью режима спектрофторометра. В конце кинетического анализа немедленно приобретайте посткинетикую визуализацию изображения пластины, как это было продемонстрировано для предкинетики. Чтобы определить количество клеток на основе ядерной флуоресценции, в программном обеспечении для перечисления микропластицовых ячеек в настройках, выберите повторное анализ, а в настройках анализа изображений выберите дискретный анализ объектов, используя 541 в качестве длины волны для поиска объектов.
В варианте поиска объектов используйте метод поиска изображений, выберите ядра и нажмите кнопку apply, затем нажмите OK и прочитайте, чтобы инициировать алгоритм подсчета ячеек. Выражение GFP не препятствует измерениям интенсивности пропидия йодида при наличии или отсутствии листериолизина O лечения. Выражение йодида пропидия может кровоточить через флуоресценцию GFP, о чем свидетельствует увеличение интенсивности флуоресценции GFP в клетках HeLA H2B-GFP в анализе посткинетики по сравнению с предкинетического анализа.
Важно, однако, что этот кроссовер не влияет на подсчет клеток, так как процесс сегментации, участвующий в перечислении ядер, не зависит от увеличения флуоресценции GFP. При отсутствии листериолизина O целостность плазменной мембраны остается постоянной при наличии или отсутствии внеклеточного кальция, в то время как листериолизин O лечение в присутствии кальция дополняет средние результаты в неуклонном увеличении интенсивности флуоресценции пропидия йодида. При отсутствии внеклеточного кальция, однако, есть значительно круче увеличение пропидия йодидной флуоресценции, что отражает отсутствие мембранного перепечатки.
Кроме того, карбоцианина нуклеиновой кислоты связывания красителя с флуоресценцией в крайнем красном может быть заменен на иодид пропидия, чтобы свести к минимуму спектральное перекрытие с GFP. Кроме того, более высокий коэффициент возбуждения для дальнего красного красителя имеет более высокое отношение сигнала к шуму и лучшее разрешение между разрешительными и ремонтными ограничительными условиями. При попытке этой процедуры, рекомендуется маркировать все трубки за день до эксперимента, так как это подготовит вас ко всем реагент подготовки в день эксперимента.
После этой процедуры, другие методы, такие как цитометрия изображения могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как поры формирования токсина повреждения всех клеток равномерно или некоторые клетки более восприимчивы, чем другие. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области инфекционных заболеваний и плазменных мембран ремонт изучить влияние размера поры на эффективность ремонта различных типов клеток.
