Общая цель этой статьи, заключается в стандартизации протокола для изоляции, характеристики и дифференциации сердечных стволовых клеток, CSCs от adult Mouse Heart. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, в области сердечно-сосудистых заболеваний и региональной терапии, таких как, сердечной терапии стволовыми клетками и сердечной недостаточности. Основным преимуществом этого метода является то, что он является экономически эффективным, с высокой помощью в небольшой период времени.
Начните этот эксперимент с подготовки всех необходимых материалов, инструментов и буферов изоляции в стерилизованной состоянии, как описано в протоколе. После удаления кожи из брюшной полости усыпанной мыши, вырезать грудную клетку внутри стерильного капюшона, чтобы открыть грудную полость. Разоблачить сердце, а затем удалить кровь рядом с сердцем с помощью одного миллилитров шприца.
Чтобы удалить кровь рядом с сердцем, мыть окрестности с ледяной PBS. Используя хирургические ножницы и пинцет, чтобы вскрыть сердце, поместите его в 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую 10 миллилитров ледяной PBS. Используйте изогнутые миппы хвостовика, чтобы учащенное сердцебиение, и удалить остаточную кровь внутри сердца.
Перенесите четыре-пять изолированных сердец на 100 миллилитровую чашку Петри, содержащую 10 миллилитров сбалансированного соленого раствора ледяной ветчины. Пальпировать сердца снова мыть их и удалить остатки крови внутри сердца. Чтобы обеспечить полное удаление крови, измените раствор HBSS после каждой стирки.
Держите каждое сердце с парой типсов и используйте хирургическое лезвие, чтобы разрезать каждое сердце на два-четыре миллиметра кусочки в 100-миллиметровой чашке Петри, содержащей пять-семь миллилитров HBSS. Часто меняют раствор, чтобы обеспечить полное удаление крови. Наконец, фарш сердца в решении HBSS.
Центрифуга фарш сердца помещены в 50 миллилитров конической трубки при 500 раз G, при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут, а затем отказаться от супернатанта. Добавьте от пяти до шести миллилитров, 0,2%Collagenase II раствор гранулы, чтобы переварить ткани. Повторно приостанавливайте гранулы тщательно, качая трубку на шейкере при 75 раз G, при 37 градусах по Цельсию в течение 45 до 60 минут.
Каждые 20-30 минут энергично встряхивай трубку вручную, чтобы усилить лиз. Тритурат лизированную смесь тканей с использованием пяти миллилитров серологической пипетки, и один миллилитр пипетки отзыв разобщить ткани комок в одноклеточной подвески. Чтобы остановить энзиматический лиз ткани, добавьте в два-три раза больше коммерчески доступных средств обслуживания CSC, чем объем лизинной ткани.
Перейдите усваиваемой клеточной подвески через 100 микрометровый ситечко клеток, помещенных на 50 миллилитров конической трубки, чтобы удалить любые непереваренные части ткани. Чтобы отделить клетки от градиентной центрифугации плотности, добавьте 37 градусов по Цельсию, предварительно разогретый, полисуцероз и диатризоатный раствор натрия в 50 миллилитровую коническую трубку. Затем осторожно и медленно добавить равный объем фильтрата над раствором, избегая любого смешивания двух решений.
Очень важно, чтобы добавить фильтрат над полисуцозой и натрием диатризоат раствор медленно, не смешивая, наклоняя трубку на 45 градусов и против стенки трубки. Не добавляйте полисуцозу и диатризоатный раствор натрия над фильтратом. Поместите трубку очень медленно в качели ведро центрифуги убедившись, что не беспокоить решения.
Центрифуга при 500 раз G в течение 20 минут при комнатной температуре устанавливается при более низкой скорости ускорения и замедления, чтобы избежать смешивания двух растворов, а также для правильного разделения сердечных стволовых клеток. Очень важно очень осторожно поставить градиентный раствор без помех в центрифугу. Положите ускорение и замедление центрифуги должны быть на самой низкой скорости, например, один или ноль.
Используйте одномиллиметровую пипетку для переноса баффи пальто, содержащего CSCs вместе с дополнительным раствором из верхнего слоя в 15 миллилитров стерилизованной трубки. Добавьте равный объем среды обслуживания CSC и смешайте его должным образом, чтобы нейтрализовать остаточный раствор полисуцозы и диатризоата натрия. Центрифуга этой подвески на 500 раз G в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию.
Откажитесь от супернатанта. Повторите стирку CSCs с неполным решением DMEM по крайней мере в течение двух раз. Центрифуга при 500 раз G в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию, чтобы избавиться от любого остаточного раствора полисуцозы и диатризоата натрия.
После удаления супернатанта, повторно расходовать гранулы, содержащие очищенные CSCs в один миллилитр CSC обслуживания среды, а затем подсчитать клетки. Семя CSCs в шесть хорошо культуры пластины покрыты 0,02%желатина раствор, содержащий 0,5%фибронектин, и добавить два миллилитров полного обслуживания среды. Выращиваем клетки при 37 градусах Цельсия при 5%CO2.
Когда культура CSC достигает слияния, перенесите клетки на новую пластину с покрытием желатина и фибронектина, как описано в текстовом протоколе. Культура эти переданы P0 CSCs в полном CSC обслуживания среды при 37 градусов по Цельсию в 5%CO2 инкубатор до слияния. Повторите передачу ячейки на новую пластину, чтобы сделать P1 CSCs, которые могут быть использованы для дальнейших экспериментов.
Для поддержания культуры CSC на начальном этапе, семян клеток далее, как описано в текстовом протоколе. Чтобы охарактеризовать культурные клетки, поместите CSC, содержащую пластину, на цель флуоресцентного микроскопа. Используйте десятикратное увеличение, чтобы сфокусировать клетки.
Чтобы наблюдать за клетками, используйте диафрагму фазового контраста и увеличьте увеличение в 20 раз, изменив объектив цели, а затем изувечьте CSC. После выполнения иммуностимулятора поместите культурную пластину под флуоресцентный микроскоп. Сосредоточьте клетки на различных увеличениях, и наблюдайте клетки под контрастом фазы и по-разному фильтрах возбуждения, и сохраните изображения.
Для дифференциации клеток, расти CSCs в шесть хорошо пластины с двумя миллилитров 37 градусов по Цельсию, предварительно нагревается CSC обслуживания среды. Когда клетки достигают 80 до 95% слияния, заменить обслуживание среды с двумя миллилитров, 37 градусов по Цельсию, предварительно разогретых кардиомиоцитов дифференциации среды. Инкубационный при 37 градусах по Цельсию, в 5%CO2 на срок до двух-трех недель.
Изменение среды дифференциации каждые два-три дня. Во время среднего изменения, наблюдать морфологии клеток под микроскопом, чтобы обеспечить хорошие условия культуры. Через 12 дней, изображение клеток для дифференциации маркеров после стандартного протокола иммуностимулятора.
Два-три дня культурных CSCs показать шпиндель формы морфологии при наблюдении под фазово-контрастным микроскопом. После семи дней культуры, они показывают изменения в морфологии становится удлиненным. После иммуностиминга для маркеров плюрипотентности, CSCs показывают выражения OCT4, SOX2 и Nanog.
Кроме того, CSCs распространяются в среде культуры, и выразить распространение маркер Ki67. Для характеристики сердечного происхождения CSCs, выражение сердечных маркеров было изучено, и клетки показали, чтобы быть положительным для сердечных маркеров Sca-1, NKX2.5, и GATA4. После культивирования в кардиомиоцитов дифференциации среды в течение 12 дней, дифференцированные CSCs показать выражение кардиомиоцитов маркеров ACTININ, и TROPONIN-I.
При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы не допустить смешивания градиентного раствора и фильтрата. Важно также установить ускорение и замедление на самой низкой скорости. Тот, кто загрязняет их, рекомендуется выполнять все процесс изоляции клеток внутри биобезопасности кабинета.
После этой процедуры, другие методы, такие как магнитно-бисер основе разделения или потока цитометических методов сортировки клеток могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как, насколько ясно однородной популяции сердечных стволовых клеток? Радиус трещины в сердечной стволовой клетке является большим маркером, и есть различия в сторону кардиомиоцитов. После его развития, этот метод проложит путь для исследователей в области сердечно-сосудистых заболеваний, которые часто высокий выход сердечных стволовых клеток из сердца мыши, которые могут быть важны для регенеративной терапии при ишемической сердечной недостаточности.
Не забывайте, что работа с хирургическим лезвием, отбеливателем и DMSO может быть опасной, и такие меры предосторожности, как использование защитного оборудования персонала, СИЗ, всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
