Этот метод может помочь производить большое количество рекомбинантных РНК, представляющих интерес для применения в исследованиях или промышленности. Основным преимуществом является то, что рекомбинантная РНК производится в кишечной палочке в дешевом процессе, который может быть легко расширен. Важно отметить, что РНК производится на круговой РНК эшафот, который облегчает очищение однородности.
В отличие от ДНК или белков, РНК, представляющие интерес, не легко производятся в больших количествах в биофакторных системах, таких как культура кишечной палочки. Наш метод основан на совместное выражение РНК интереса вставляется в высоко стабильной круговой эшафот и применения лигазы, что опосредует РНК круговой. Круговая РНК эшафот происходит от запатентованного вироида.
Вироиды являются относительно небольшими, не спиральный, высоко базовые пары круговых РНК, которые являются инфекционными для некоторых высших растений. Мы можем производить десятки миллиграммов рекомбинантной РНК на литр бактериальной культуры в обычных лабораторных условиях. Чтобы начать эту процедуру, усилить cDNA ПЦР, как указано в текстовом протоколе.
Затем добавьте 100 нанограмм плазмидных пЛЕЛВД-БЦБ в 0,5 миллилитровую трубку. Добавьте 10 U фермента ограничения IIS BpiI и достаточно буфера G, чтобы создать 20 микролитровую реакцию. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа, чтобы переварить плазмиду.
После этого отделяем продукты ПЦР и пищеварения электрофорезом в один процент агарозного геля в буфере TAE. Пятно гель, встряхивая его в 200 миллилитров бромистого этидия в концентрации 0,5 микрограмма на миллилитр. Используя УФ-трансиллюминатор, визуализуйте ДНК.
Используйте скальпель, чтобы вырезать полосы, соответствующие усиленным CDNA и BpiI переваренной плазмидной. Используя столбцы кремнезема геля, elute DNAs от фрагментов геля. Количественная оценка концентрации ДНК с помощью спектрофотометрического анализа.
Настройка реакции Ассамблеи Гибсона с использованием усиленного CDNA и переваренной плазмиды. Инкубировать при 50 градусах по Цельсию в течение одного часа. Затем используйте колонку кремнеземного геля для очищения реакции.
После электропоездки компетентных E.coli DH5-альфа-клеток, выбрать несколько белых колоний и передать их в жидкой среде LB. Выращиваем колонии на ночь при 37 градусах по Цельсию. Затем используйте комплект miniprep для очистки плазмидов и анализа их размеров с помощью электрофореза в одном проценте агарозного геля в буфере TAE.
Во-первых, со-электропорат выбранного штамма E.coli с производной pLELVd-B'B, которая содержит cDNA, соответствующую РНК интереса, и плазмидной P15LTRNISM для совместного выражения баклажана tRNA ligase. Передача SOC жидкой среды в кюветт электропорации для восстановления клеток, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение одного часа. Затем пластины бактерий на LB твердой среде, содержащей 50 микрограммов на миллилитр ампициллина, и 34 микрограмм на миллилитр хлорамфеникол.
Инкубировать при 37 градусах по Цельсию за одну ночь. На следующий день добавьте 250 миллилитров жидкого ТБ среднего, содержащего 50 микрограмм на миллилитр ампициллина, и 34 микрограмма на миллилитр хлорамфеникол, в одну литровую сбитую с толку колбу Эрленмейера. Извлекит инкубированную E.Coli, а затем выберите колонию и прививки среды в колбе.
Инкубировать при 37 градусах по Цельсию с энергичной тряской при 180 об/мин в течение 12 до 16 часов до сбора бактерий. Налейте собранную культуру E.Coli в бутылку центрифуги 250 миллилитров и вращайте клетки при 14 000 Г в течение 10 минут. Откажитесь от супернатанта и повторно посовелите клетки в 30 миллилитров воды.
Перенесите эту подвеску в центрифугу и снова вращайте клетки, используя предыдущие условия. Отбросьте супернатант и добавьте 10 миллилитров хроматографического буфера в клеточные гранулы. Вихрь для повторного перерасхода ячеек в буфере.
Добавьте один том фенола: хлороформа и вихря энергично, чтобы сломать клетки. Затем центрифуга при 12 000 Г в течение 10 минут. Восстановите aqueous фазу, добавьте один том хлороформа, и вихрь энергично.
Центрифуга при 12 000 Г в течение 10 минут. После этого процепивте препарат РНК через 45-метровый фильтр шприца. Очистить РНК с помощью одного миллилитров дитил этанола амина колонки подключены к жидкой хроматографии системы.
Отрегулируйте скорость потока до одного миллилитра в минуту и уравновесите столбец 10 миллилитров хроматографического буфера. Затем загрузите образец и вымойте столбец 10 миллилитров хроматографического буфера. Уберите РНК с 20 миллилитров буфера элюции, и собрать один миллилитр aliquots.
Используя двухмерный полиакриламид гель электрофорез, отделяйте круговые РНК от их линейных аналогов. Во-первых, подготовить пять процентов полиакриламинид гель в буфере TBE и содержащие восемь молярной мочевины, как указано в текстовом протоколе. Смешайте 20 микролитров РНК-препаратов с одним объемом буфера загрузки.
Инкубировать при 95 градусах по Цельсию в отопительном блоке в течение 1,5 минуты, а затем оснастки охлаждения на льду. Загрузите образцы в полиакриламинидный гель и запустить электрофорез в соответствующих условиях для измерения геля. После этого, пятно гель в 0,5 микрограмма на миллилитр бромистого этидия в течение 15 минут.
Вымойте окрашенный гель водой, а затем визуализировать РНК под ультрафиолетовым светом. Электрофоретический анализ нескольких рекомбинантных плазмидов, в которые вставляются различные цДНК, показывает различные миграции по сравнению с pLELVd-B'B. Обратите внимание, что pLELVd-B'B содержит маркер лака, который заменяется cDNA, соответствующим РНК интереса, поэтому, хотя миграция зависит от размера вставленного cDNA, рекомбинантные плазмиды обычно мигрируют быстрее, чем плазмида управления.
Производство рекомбинантной РНК в со-электропорированных бактериальных культурах контролируется путем разрушения клеток и анализа РНК путем денатурации PAGE. Можно увидеть сильные полосы, которые соответствуют пустым формам ELVd и химерных ELVd, в которые были вставлены различные РНК, представляющие интерес. Интересно, что большая часть рекомбинантной РНК рассматривается как круговая форма.
Круговорот основной фракции наблюдается с помощью комбинации двух ПАГВ в условиях денатурации при высокой и низкой ионной прочности. Препарат РНК может быть дополнительно очищен хроматографией анионные обмены. Как видно здесь, E.Coli РНК эффективно сохраняется при низкой ионной прочности, а затем eluted при высокой ионной прочности, при этом большая часть РНК собирается в фракции два и три.
Рекомбинантная РНК может быть дополнительно очищена до однородности 2-D электрофорезом. Этот протокол позволяет легкое производство большого количества рекомбинантной РНК в кишечной палочке и очистки однородности благодаря круговороту конечного продукта. Помните, что РНК процентных результатов встроенных в круговой РНК эшафот, полученных из растительного вироида.
Если вы хотите разделить обе moieties, вам нужно использовать стандартную стратегию, такую как рибозимы, DNAzymes, или RNase H.Доходность этого протокола зависит от конкретной РНК, представляющих интерес, так как небольшие РНК, вероятно, будут производиться в больших количествах, чем более крупные. Для более широких выражений, примите во внимание, что оптимальное время для сбора бактерий зависит от многих факторов, включая штамм E.Coli, культурную среду и условия выращивания. Мы рекомендуем предварительный анализ времени, чтобы найти оптимальное окно производства в ваших конкретных условиях.
Помните, что рекомбинантные РНК накапливаются в бактериальных клетках преходяще, и что они полностью исчезают на позднерастущем этапе.
