Наш протокол для клеточного экспрессии белка использует очень активный сырой экстракт из быстро растущей бактерии Vibrio natriegens, который готовится с использованием простого и эффективного по времени двухстугового процесса центрифугации соникации. Подготовка экстракта сырых клеток и синтез белка без клеток могут быть достигнуты в течение одного-двух дней одним пользователем, что позволяет легко интегрировать этот метод в трубопроводы для биопроизводства или применения синтетической биологии. Чтобы начать мыть один миллилитр ночь Vibrio natriegens культуры центрифугирования его в центрифуге скамейке на 10, 600 раз г в течение одной минуты.
Аспирировать супернатант, не нарушая гранулы, и повторно в один миллилитр свежих средств LB-V2. Привить один миллилитр промывают ночь культуры в один литр свежих LB-V2 роста средств массовой информации в автоклав четырехлитровый сбит с толку Erlenmeyer колбу со стерильной крышкой для достижения от одной до одной тысячи разбавления рациона. Выращиваем культуру при 30 градусах Цельсия при тряске до 225 об/мин.
Используйте спектрофотометр для мониторинга культур OD 600. А когда он достигает 1,0 плюс-минус 0,2 урожая, культура центрифугирует ее в двух 500-миллилитровых трубках по 3500 раз г в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия, а затем высовывает на лед. Аспирировать супернатант и обрабатывать гранулы немедленно.
Перед началом процедуры лиза клетки охладить свежеприготовленный S30 лиза буфер рН 7,7 примерно до четырех градусов по Цельсию, Используйте 10 миллилитров этого холодного буфера S30 лиза, чтобы вновь приостановить все гранулы в результате того же одного литра культуры. И перенесите подвеску на 50-миллилитровую трубку. Центрифуга этой суспензии на 3500 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, а затем аспирировать супернатант, не нарушая гранулы и поместить его на лед.
Работая в холодной комнате добавить 500 микролитров холодного буфера S30 лиза к грануле в 50-миллилитровой трубке, помещенной на лед. Используйте широкий наконечник пипетки, чтобы повторно использовать гранулы и тщательно перенести его в двухми миллилитровую трубку также на льду. Для того, чтобы производить очень активные сырые экстракты, мы должны убедиться, что клетки не более разбавленной буфером S30, но имеют достаточно жидкости для эффективной sonication.
Заполните 600-миллилитровый стакан со льдом и поместите двухми миллилитровый держатель трубки поверх льда. Вихрь трубки кратко гомогенизировать клетки. Флик, чтобы удалить любые клетки на дне крышки, и поместить в трубку держатель с крышкой открытым.
Нижний наконечник sonicator в клеточной подвеске в трубке, так что он находится только под жидкой поверхностью. Подготовь настройку sonication с помощью звукового и зонда диаметром 1/8 дюйма. Установите звуковой на частоте 20 килогерц и 50%амплитуды.
Импульс-на время 10 секунд, и импульс-время от 60 секунд. Запустите протокол звуковой связи импульса в течение трех циклов. А затем центрифуга сырой экстракт клеток в 16000 раз г в течение 30 до 45 минут при четырех градусах по Цельсию, пока лисейс не освободится от любого клеточного мусора.
Визуальное осматривание лиза клеток по мере того, как происходит звуковое воздействие, имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы звуковое воздействие работало так, как ожидалось. Работа в холодной комнате aliquot 50 микролитров в результате supernatants на новые двухми миллилитровые трубки убедившись, что не беспокоить гранулы. Чтобы флэш заморозить эти сырые экстракты клеток место труб в трубку держатель с погружением строки прилагается и погрузиться в двойку, содержащую жидкий азот и проверить, если замороженные.
Для выполнения клеточного экспрессии белка с помощью шаблона ДНК оттепель 10X энергетическое решение мастер смеси, 4X аминокислоты мастер смесь aliquots, и шаблон ДНК при комнатной температуре. Затем удалите полимеразу T7 РНК и запасы ингибитора РНКзы из морозильной камеры минус 20 градусов по Цельсию и поместите на лед. После того, как шаблон ДНК, 10X энергетическое решение мастер смеси, и 4X аминокислоты мастер смесь разморожена, место на льду.
Подготовьте микс мастера реакции без клеток, добавив каждый компонент в точном порядке к двухми миллилитровой трубке на льду, и аккуратно щелкнуть трубку после каждого добавления к мастер-миксу. Удалить Vibrio natriegens сырой клетки лишат из минус 80 градусов по Цельсию морозильник и место на льду в течение 10 до 20 минут, пока оттаял. Добавьте соответствующий объем разморожевания экстракта сырой клетки в микс без клеток и аккуратно перемешайте с помощью пипетки.
Для выполнения конечной точки клеточной свободной экспрессии белка с помощью термоциклера, сначала добавьте 10 микролитров клеточной реакции мастер смесь на колодец нижней части 96-хорошо ПЦР пластины убедившись, что смешивать мастер смесь, стряхивая трубку мягко между каждой передачи на пластину ПЦР. Центрифуга пластины на 1000 раз g в течение 10 секунд, чтобы объединить любой мастер смеси, которые, возможно, застряли в стороны скважин. А затем запечатать колодцы с клеем пластины, чтобы предотвратить испарение.
Поместите пластину в термоциклер при 26 градусах Цельсия с нагретой крышкой при 105 градусах по Цельсию. После инкубации реакций в пластине ПЦР в течение как минимум трех часов, выраженные белки могут быть очищены, количественно и использованы для процессов вниз по течению. Для мониторинга клеточного экспрессии белка кинетики с помощью пластины считыватель пипетки 10 микролитров на колодец клеточной реакции мастер смесь в нижней части черного 384-ну анализ пластины с четкими стеклянными днами.
И запечатать скважины с четким клеем пластины, чтобы предотвратить испарение. Поместите анализную пластину в считыватель пластин, установленный на уровне 26 градусов по Цельсию и инкубировать в течение трех-шести часов при мониторинге соответствующих флуоресцентных возбуждения / выбросов длин волн, соответствующих выраженному белку. Система экспрессии без клеток, описанная в этом протоколе, достигает наилучших результатов с помощью плазмидного шаблона ДНК, который дает значительно большее количество белка, чем такое же количество линейной ДНК, как показано на конечной точке и кинетических анализах.
мРНК, генерируемая транскрипционными реакциями in vitro, также может быть использована, но требуется большее количество мРНК. На урожайность белка существенно повлияла концентрация ионов магния и калия. В оптимизированных условиях оптимальная концентрация ионов магния была установлена на уровне 3,5 миллимолара, а для иона калия - 80 миллимоля.
Таким образом, отклонения от этих оптимальных концентраций ионов могут привести к снижению способности этой системы выражения производить значительные урожаи белков. Важно, чтобы все реагенты на льду или работать в холодихой как можно больше. Кроме того, надлежащее и полное звуковое око решающее значение для успеха этого протокола.
Следуя этому протоколу, пользователи будут иметь возможность выражать белки в формате высокой пропускной способности, которые могут быть использованы для очистки и проверки на активность различных белков. Этот метод демонстрирует использование новых организмов с уникальными свойствами для свободного от клеток выражения. Vibrio natriegens является галофильной быстрорастущей бактерией, которая может предложить уникальные условия для выражения белков или малых молекул, ранее не изученных в установленных модельных организмах.
