Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области торговли белками о ядерной и цитоплазмической транслокации в системе, в рамках которой световой визуализации нет. Основным преимуществом этой техники является то, что она может быть применена в качестве общего протокола для изучения движения височного белка без привлечения световой визуализации. От 20 до 24 часов до начала вирусной инфекции семян 5 раз 10 до 4 человеческих эмбриональных легких или HEL волокна взрывных клеток на хорошо на четыре хорошо 11 миллиметров шахматном слайд и рост среды для ночной инкубации при 37 градусов по Цельсию с пятью процентами двуокиси углерода.
Важно, чтобы рок слайд тщательно, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток, заботясь, чтобы избежать разлива культуры среды. На следующий день, заменить supernatants так 70 до 80 процентов слияние культур со средним 199, содержащий 410 доска формирования единиц на клетку, и место слайд на 37 градусов по Цельсию со тряской, в течение одного часа. В конце инкубации замените супернатанты свежей средой роста и верните клетки в инкубатор для соответствующего экспериментального инфекционного периода.
Для иммунофлуоресцентного окрашивания инфицированных вирусом клеток, быстро мыть клетки три раза с PBS. Затем от восьми до десяти минут инкубации в 200 микролитров четыре процента параформальдегида в PBS на колодец. В конце фиксации, мыть клетки три раза с 200 микролитров PBS на стирку, и пронизывают клетки с 100 микролитров 0,2 процента неионных сурфактант на хорошо в течение пяти-десяти минут.
Вымойте проницаемые клетки три раза в PBS, как попродемонстрировано, и добавьте 200 микролитров блокирующего буфера к каждому колодец в течение одного часа инкубации при комнатной температуре. Далее добавьте соответствующую концентрацию первичного антитела, представляющих интерес для каждой хорошо для двухчасовой инкубации комнатной температуры. В конце инкубации удалите любое несвегаемое первичное антитело с тремя, десятиминутными стирками в свежем блокирующего буфере и добавьте соответствующее вторичное антитело к каждому колодец для часовой инкубации при комнатной температуре, защищенной от света.
В конце инкубации, мыть клетки три раза в блокирующий буфер, как попродемонстрировано, а затем один мыть в PBS и добавить одну каплю антифада монтажа среды дополняется DAPI к каждому хорошо. Затем поместите крышку скольжения по слайду и запечатать крышку склона с прозрачным лаком для ногтей. Применение мягкого давления при монтаже крышки скольжения будет удалить любые избыточные монтаж среды, помогая обеспечить обеспечение приобретения высококачественных изображений.
Для конфокального изображения помеченных, инфицированных клеток выберите соответствующие вторичные антитела и длины волн DAPI и установите формат изображения до 1 024 на 1024 пикселей со средней линией восемь. Затем изображение каждого хорошо на четыре хорошо слайд под 100x цели. Для подсчета большого количества ячеек, получить пять-десять изображений из последовательных полей в том же хорошо под 40x цели.
Чтобы проанализировать ядерное и цитоплазмическое распределение ICP0, откройте проект в программном обеспечении конфокального применения и выберите изображение. Откройте вкладку Количество и выберите сортировать регионы, представляющие интерес, из меню Инструменты. Выберите линию рисовать и нарисуйте продольную линию по всей ячейке для анализа.
Гистограмма появится показаны флуоресценции интенсивности вдоль линии как для белка интереса, и DAPI. На основе фонового окрашивания установлен постоянный порог интенсивности белка, представляющий интерес для анализа субклеточного распределения белка в каждом эксперименте. Если белковый сигнал в среднем находится ниже порога в ядерной области, но выше порога за границей DAPI, классифицировать белковый сигнал как преимущественно расположенный в цитоплазме.
Если белковый сигнал находится выше порога по всему ядру и за пределами границы сигнала DAPI, сгруппив белковый сигнал как ядро плюс цитоплазмическую локализацию. Если белковый сигнал выше порога в ядре, но в среднем находится ниже порога за пределами границы сигнальной группы DAPI, то белковый сигнал как ядерная локализация. Наконец, табулировать более 200 инфицированных клеток из каждой выборки в разных точках времени инфекции, и график данных в бар график, чтобы проиллюстрировать движение белка интереса с течением времени.
Как было продемонстрировано, этот метод облегчает анализ ядерной к цитоплазмической транслокации белков, представляющих интерес. Например, инфицированный клеточный белок ноль, или субклеточное распределение ICP0 изменяется по мере развития вирусной инфекции. Чтобы понять элементы, необходимые для торговли ICP0 во время инфекции, движения ICP0 можно отслеживать в диких типах и мутантного типа герпеса Simplex Вирус 1-инфицированных клеток на различных стадиях инфекции, что позволяет оценки субклеточного распределения ICP0 в разные моменты времени инфекции.
Важно помнить использовать монослойные культуры, чтобы вирилы имели равный доступ к клеткам и нормализовать множественность инфекции в соответствии с названием вируса, так что прогрессирование инфекции сопоставимо между вирусами и внутри них. После каждого развития, этот метод проложил путь для исследователей в области биологии и клеточной вирусологии, чтобы исследовать движение белка, изучая височную субклеточную локализацию белков, представляющих интерес в клеточной популяции.
