이 방법은 빛 화상 진찰을 사용할 수 없는 시스템에서 핵과 세포질 전좌에 관하여 단백질 인신 매매 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 광 화상 진찰을 포함하지 않고 측두단백질 운동의 연구를 위한 일반적인 프로토콜로 적용될 수 있다는 것입니다. 바이러스 감염 전 20~24시간 전에 5배 10번~ 4개의 인간 배아 폐 또는 HEL 섬유 폭발 세포가 잘 4개의 우물에 11mm 비틀거리고 성장 배지가 37°C에서 이산화탄소를 5%로 하였다.
배양 배지가 유출되는 것을 피하면서 세포의 균일한 분포를 보장하기 위해 슬라이드를 철저히 흔들어야 합니다. 다음 날, 슈퍼네이츠를 교체하여 70~80%의 수렴 문화를 199로, 셀당 410개의 플라크 형성 유닛을 포함하고, 슬라이드를 섭씨 37도에서 1시간 동안 흔들어 놓습니다. 인큐베이션의 끝에서, 수퍼네티를 신선한 성장 배지로 대체하고 적절한 실험 감염 기간 동안 인큐베이터로 세포를 반환한다.
바이러스에 감염된 세포의 면역 형광 염색의 경우 PBS로 세포를 세 번 빠르게 씻으실 수 있습니다. 그 다음으로 PBS에서 4%의 파라포름알데히드의 200마이크로리터에서 8분에서 10분 배양이 이어졌습니다. 고정의 끝에서, 세척 당 PBS의 200 마이크로 리터로 세포를 세 번 세척하고, 5 ~ 10 분 동안 잘 100 마이크로 리터의 0.2 %의 비 이온 계면 활성제로 세포를 퍼메아빌화.
입증된 대로 PBS에서 투과된 세포를 세 번 세척하고 실온에서 1시간 배양을 위해 각 웰에 200마이크로리터의 블로킹 버퍼를 추가합니다. 다음으로, 2시간 실온 인큐베이션을 위해 각 웰에 관심 있는 1차 항체의 적절한 농도를 추가한다. 인큐베이션의 끝에서, 신선한 차단 버퍼에 3, 10 분 세척과 모든 언바운드 기본 항체를 제거하고, 빛으로부터 보호 실온에서 1 시간 배양에 대한 각 우물에 적절한 이차 항체를 추가합니다.
인큐베이션이 끝나면, 입증된 대로 블로킹 버퍼에서 세포를 세 번 씻고, PBS에서 한 번 세척한 다음, DAPI로 보충된 안티페이드 장착 배지 1방울을 각 웰에 첨가한다. 그런 다음 슬라이드 위에 덮개 슬립을 놓고 투명한 매니큐어로 커버 슬로프를 밀봉합니다. 커버 슬립을 장착하는 동안 부드러운 압력을 가하면 과도한 장착 매체가 제거되어 고품질 이미지를 획득하는 데 도움이 됩니다.
표지된 감염된 세포의 공초점 이미징의 경우 적절한 이차 항체 및 DAPI 파장을 선택하고 이미지 포맷을 평균 8개의 라인으로 1, 024 x 1, 024 픽셀로 설정합니다. 그런 다음 100x 목표 아래 4웰 슬라이드에서 각 우물을 이미지합니다. 셀의 큰 숫자를 계산하기 위해, 40배 목표 하에서 동일한 웰의 연속 필드에서 5~10개의 이미지를 얻을 수 있습니다.
ICP0의 핵 및 세포질 분포를 분석하려면 공초점 응용 소프트웨어에서 프로젝트를 열고 이미지를 선택합니다. 수량 탭을 열고 도구 메뉴에서 관심 영역 정렬을 선택합니다. 그리기 선을 선택하고 분석할 셀 전체에 세로선을 그립니다.
히스토그램은 관심 있는 단백질과 DAPI 모두에 대한 선을 따라 형광 강도를 나타내는 것으로 나타납니다. 배경 염색에 기초하여, 각 실험에서 단백질의 세포 분포의 분석을 위해 관심 있는 단백질의 강도에 대한 일정한 임계값을 설정한다. 단백질 신호가 평균적으로 핵 영역에서 임계값 미만이지만 DAPI 경계를 넘어 임계값을 초과하는 경우 단백질 신호를 주로 세포질 내에 있는 것으로 분류한다.
단백질 신호가 핵 전체의 임계값 을 초과하고 DAPI 신호의 경계를 넘어서면 단백질 신호를 핵 플러스 세포질 국소화로 그룹화한다. 단백질 신호가 핵의 임계값 이상인 경우, 평균적으로 DAPI 신호군의 경계 외부임계값 이하인 경우 단백질 신호는 핵 국소화로서 이다. 마지막으로, 각 샘플에서 200개 이상의 감염된 세포를 상이한 감염 시점에서 표로 꾸미고, 시간이 지남에 따라 관심 있는 단백질의 움직임을 설명하기 위해 바 그래프로 데이터를 플롯한다.
입증 된 바와 같이,이 방법은 관심있는 단백질의 핵 세포질 전좌의 분석을 용이하게한다. 예를 들어, 감염된 세포 단백질 제로, 또는 ICP0 세포 세포 분포는 바이러스 감염이 진행됨에 따라 변화한다. 감염 시 ICP0 인신매매에 필요한 요소를 이해하기 위해 ICP0 운동은 다른 감염 단계에서 야생 유형 및 돌연변이 유형 헤르페스 심플렉스 바이러스 1-감염된 세포에서 추적될 수 있으며, 감염의 다른 시간 지점에서 ICP0의 하위 세포 분포의 평가를 허용합니다.
바이러스가 세포에 동등한 접근을 가지고 있고 감염 진행이 바이러스 사이 및 내의 비교되도록 바이러스 제목에 따라 감염의 복합성을 정상화하기 위하여 단층 배양을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 각 발달 후에, 이 기술은 세포 인구 내의 관심 있는 단백질의 시간적 세포 소소화를 공부하여 단백질 운동을 탐구하는 생물학과 세포 바이러스학의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다.
