Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do tráfico de proteínas sobre translocação nuclear e citoplasmática no sistema no qual a imagem de luz não está disponível. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser aplicada como protocolo geral para o estudo do movimento da proteína temporal sem envolver imagens leves. 20 a 24 horas antes da infecção do vírus se semear 5 vezes 10 para 4 células de explosão de fibra embrionária humana ou de fibra HEL por poço em um slide de quatro poços escalonados e meio de crescimento para incubação durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
É importante balançar completamente o slide para garantir uma distribuição uniforme das células, tomando cuidado para evitar derramar o meio de cultura. No dia seguinte, substitua os supernantes para que as culturas confluentes de 70 a 80% com o Medium 199, contendo 410 unidades de formação de placas por célula, e coloque o slide a 37 graus Celsius com agitação, por uma hora. Ao final da incubação, substitua os supernacantes por meio de crescimento fresco e devolva as células à incubadora para o período de infecção experimental adequado.
Para a coloração imunofluorescente das células infectadas pelo vírus, lave rapidamente as células três vezes com PBS. Seguido por uma incubação de oito a dez minutos em 200 microlitradores de 4% de paraformaldeído em PBS por poço. Ao final da fixação, lave as células três vezes com 200 microlitadores de PBS por lavagem, e permeabilize as células com 100 microliters de 0,2% surfactante não iônico por poço por cinco a dez minutos.
Lave as células permeabilizadas três vezes em PBS como demonstrado, e adicione 200 microliters de tampão de bloqueio a cada poço para uma incubação de uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, adicione a concentração adequada do anticorpo primário de interesse a cada poço para uma incubação de duas horas de temperatura ambiente. No final da incubação, remova qualquer anticorpo primário desvinculado com três, dez minutos de lavagem em tampão de bloqueio fresco, e adicione um anticorpo secundário apropriado a cada poço para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente, protegido da luz.
No final da incubação, lave as células três vezes em um tampão de bloqueio como demonstrado, seguido de uma lavagem em PBS e adicione uma gota de meio de montagem antifato complementado com DAPI para cada poço. Em seguida, coloque uma tampa escorregando sobre o slide e sele a inclinação da tampa com esmalte transparente. A aplicação de pressão suave durante a montagem do deslizamento de cobertura removerá qualquer meio de montagem em excesso, ajudando a garantir a aquisição de imagens de alta qualidade.
Para imagens confocal das células rotuladas e infectadas, selecione o anticorpo secundário apropriado e comprimentos de onda DAPI, e defina o formato de imagem para 1.024 por 1.024 pixels com uma linha média de oito. Em seguida, imagem cada poço no slide de quatro poços sob o objetivo de 100x. Para contar um grande número de células, obtenha de cinco a dez imagens de campos consecutivos no mesmo poço abaixo do objetivo de 40x.
Para analisar a distribuição nuclear e citoplasmática do ICP0, abra o projeto no software de aplicação confocal e selecione uma imagem. Abra a guia Quantidade e selecione Classificar regiões de interesse no menu Ferramentas. Selecione Desenhar linha e desenhe uma linha longitudinal através da célula a ser analisada.
Um histograma aparecerá mostrando a intensidade da fluorescência ao longo da linha tanto para a proteína de interesse, quanto para DAPI. Com base na coloração de fundo, configure um limiar constante para a intensidade da proteína de interesse para análise da distribuição subcelular da proteína em cada experimento. Se o sinal proteico, em média, estiver abaixo do limiar na região nuclear, mas estiver acima do limiar além do limite da DAPI, categorize o sinal proteico como predominantemente localizado dentro do citoplasma.
Se o sinal proteico estiver acima do limiar em todo o núcleo, e além do limite do sinal DAPI, agrupar o sinal de proteína como núcleo mais a localização citoplasmática. Se o sinal de proteína estiver acima do limiar no núcleo, mas em média está abaixo do limiar fora do limite do sinal DAPI, o sinal de proteína agrupa o sinal de proteína como uma localização nuclear. Finalmente, tabular mais de 200 células infectadas de cada amostra em diferentes pontos de tempo de infecção, e traçar os dados em um gráfico de barras para ilustrar o movimento da proteína de interesse ao longo do tempo.
Como demonstrado, este método facilita a análise da translocação nuclear-citoplasmática de proteínas de interesse. Por exemplo, a proteína celular infectada zero, ou iCP0 mudanças de distribuição subcelular à medida que uma infecção viral progride. Para entender os elementos necessários para o tráfico de ICP0 durante a infecção, os movimentos ICP0 podem ser rastreados em células infectadas pelo Tipo Selvagem e No Tipo Mutante Herpes Simplex 1-infectadas em diferentes fases de infecção, permitindo a avaliação da distribuição subcelular de ICP0 em diferentes pontos de tempo de infecção.
É importante lembrar de usar culturas de monocamadas para que os virions tenham acesso igual às células e normalizar a multiplicidade de infecção de acordo com o título do vírus para que a progressão da infecção seja comparável entre e dentro dos vírus. Após cada desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores das áreas de biologia e virologia celular explorarem o movimento proteico estudando as localizações subcelulares temporais de proteínas de interesse dentro de uma população celular.
