Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области рнк биологии о механизме и функции поляризации РНК локализации. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет в режиме реального времени визуализировать эндогенную РНК-торговлю живыми тканями. Последствия этого метода распространяются на терапию заболеваний, связанных с РНК, поскольку она имеет потенциал для выявления новых терапевтических целей.
Хотя этот метод может дать представление о РНК-процессах в яичной камере плодовой мухи, он также может быть применен к другим системам, таким как зебрафиш или клетки культуры. Как правило, лица, новые для этого метода будет бороться из-за проблем, связанных с проектированием и поставкой молекулярного радиомаяка реквизита. Для микроинъекции молекулярного маяка выберите цель масла 40X и смонтировать крышку с расчлененной яичной камерой на стадии микроскопа.
Найдите яичную камеру на средней и поздней стадии развития, которая правильно ориентирована на микроинъекцию. Затем навеяли микроинъектор с соответствующим давлением впрыска и компенсации. Используя джойстик микромипулятора, аккуратно опустите иглу, загруженную одним микролитером раствора молекулярного маяка, в масляную каплю.
Сосредоточьте наконечник на периферии поля зрения. Выполните чистую функцию, чтобы удалить воздух из кончика иглы и обеспечить, чтобы есть поток из иглы и довести иглу до домашнего положения. Сосредоточьтесь на яичной камере, которая будет microinjected и принести иглу обратно в фокус вблизи края яичной камеры.
Выполните тонкую регулировку z-позиции цели так, что мембрана, отделяющая клетки фолликула от клеток медсестры находится в фокусе. Вставьте иглу в клетку медсестры для инъекции молекулярных маяков в течение двух-пяти секунд. Чтобы обеспечить воспроизводимый успех микроинъекции, сосредоточьтесь на мембране, разделяющей клетки фолликула и клетки медсестры, которые будут введены, в то время как кончик иглы будет фокусирован с микро-манипулятором.
Когда все молекулярные маяки были введены, осторожно удалить иглу и втягивать его в домашнее положение. Измените цель на желаемое увеличение для получения изображений. Затем сосредоточьтесь на яичной камере под новой целью и начните приобретение изображения.
Для обнаружения месте молекулярных маяков, откройте изображения в изображении J.Use конвертировать в ICY инструмент для преобразования изображений обратно в ICY. Планка шкалы будет автоматически наложена на стек. При необходимости отредактировать планку масштаба через окно инспектора.
Затем актививировать значок глаз для бара масштаба под вкладкой слоя, чтобы удалить планку шкалы из исходного стека. Выберите детектор обнаружения и отслеживания, обнаружения и обнаружения, а также подтвердите текущую последовательность обнаружения входных данных и нулевой канал для входных и предобработонные параметры соответственно. Для детектора выберите обнаружить яркое пятно на темном фоне, используя силовое использование 2D длин волн для 3D только в том случае, если в стеках недостаточно z-срезов для выполнения анализа.
Выберите весы и чувствительность для каждой шкалы, добавляя больше весов для больших пятен и подтвердите, что область интереса из последовательности настроена для области интереса. Для фильтрации подтвердите, что фильтрация не была установлена, и выберите соответствующий формат файла в выходные время. Если результаты спот-детектора будут использоваться для отслеживания анализа, выберите экспорт в бассейн.
Для анализа колокализации повторите обнаружение пятна для другого канала. Для отслеживания молекулярных пятен маяка выберите обнаружение и отслеживание, отслеживание, отслеживание пятен и запуск детектора пятен, используя те же параметры, что и для обнаружения пятен. Нажмите параметры оценки и выберите желаемое целевое движение в окне всплывающего окна оценки параметров.
Затем нажмите запустить отслеживания. Чтобы визуализировать треки, выберите обнаружение и отслеживание, отслеживание и менеджер трека. Для процессора цветовой дорожки выберите включить и выбрать цвет для треков.
Из добавить процессор трека, выберите трек процессора время клипа. В окне клипера чека введите количество обнаружений, которые будут показаны до и после текущей точки времени. Сохраните информацию о треке в качестве файла трека XML и используйте значок камеры для получения скриншота результатов.
Чтобы проецировать стек по z-направлению, используйте планку поиска, чтобы найти плагин и выбрать максимальную проекцию из меню высадки. В окне инспектора выберите вкладку последовательности, холст и вращение, чтобы приспособить изображение к желаемой ориентации и получить скриншот повернутого изображения. Затем выберите область, представляющий интерес, 2D-регион, представляющий интерес, выберите область, представляющий интерес, и выберите область, интересную для изображения для обрезки.
Установите плагин наложения таймштамп и добавьте таймштамп в соответствии с инструкциями во всплывающем окне для направления о том, как разместить и отформатировать таймштамп. Чтобы изменить или добавить интервал времени, нажмите редактировать в окне свойств последовательности. Активируйте значок глаза, чтобы добавить обратно планку масштаба под вкладку слоя в окне инспектора.
Затем получить скриншот с метких результатов и сохранить изображение в обоих форматах TIFF и AVI. Используя этот метод, как было продемонстрировано, можно визуализировать модели транспортировки и локализации эндогенных мРНК с помощью молекулярных маяков на различных стадиях уогенеза и, в частности, в середине и после него. При индивидуальном введении в одной и той же стадии яичных камер, различные оскар конкретных молекулярных маяков представляют ту же модель локализации.
Молекулярные маяки, вводимые в цитоплазму клетки медсестры, свободно рассеиваются в соседние клетки медсестры, а также в яйцеклетки. Таким образом, маяки способны гибридизироваться со своими целями и генерировать сигналы флуоресценции на других участках, помимо места микроинъекции. В оскар GFP трансгенных яичных камер в середине oogenesis, анализ данных о приобретении показывает обширную колокализацию для флуоресценции сигнала генетически модифицированных GFP помечены оскар мРНК с флуоресценции сигнала обнаружены с помощью молекулярных маяков.
Кроме того, 5D стеки могут быть дополнительно проанализированы для определения траекторий оскар мРНК для транспортировки на большие расстояния как в клетке медсестры, так и в цитоплазме яйцеклеток. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области РНК биологии для изучения эндогенных материнской мРНК транспорта и локализации в яичной камере Drosophila.
