We appreciate assistance from members of the fly community, particularly Dr. Denise Montell, Dr. Lynn Cooley, and Dr. Pernille Rorth, for reagents. We thank Flybase, the Bloomington Drosophila Stock Center, and Developmental Studies Hybridoma Bank for information and providing fly stocks and antibodies, respectively. LM is supported by the Department of Education&#160;Grant, Graduate Assistance in the Areas of National Need (GAANN) training fellowship (P200A120017) and by a NIGMS Initiative for Maximizing Student Development Grant (2 R25-GM55036). A portion of the microscopy work was supported by NSF MRI grant DBI-0722569 and the Keith R. Porter Core Imaging Facility. Research was supported in part by a NSF CAREER Award (1054422) and a Basil O&#8217;Connor Starter Scholar Award from the March of Dimes, both awarded to MSG.

1. Вскрытие овариол <ol><li> Перевести около пятнадцати 2-4-дневных женского мух и несколько мужчин к новому лету пищевой флакон с добавлением активных сухих дрожжей. Используйте хлопок в качестве плагина для флаконов и добавить несколько капель воды к хлопку, чтобы сохранить высокую влажность. </li><li> Место флакона в 25 ° C инкубаторе в течение 14-16 ч, чтобы максимизировать количество стадия 8-10 яиц камер. Примечание: Время инкубации варьируется в зависимости от температуры и желаемой стадии. </li><li> Подготовка рассечение СМИ, 0,1 М КПО 4 и NP40 решения по мере необходимости в течение следующего дня (см Материалы). </li><li> Обезболить мух с помощью CO 2, и поместите под микроскопом рассечение. Внесите несколько капель рассечение СМИ в каждой полости в стекле депрессии слайда. </li><li> Держите щипцы в каждой руке на примерно 30 ° углом к ​​поверхности стола и сориентироваться одна женщина летать с опущенными крыльями. С вашей не доминантной рукой, забрать самку с помощью щипцов, схватив ее в аnterior живота, недалеко от грудной клетки, и погрузите ее в рассечение СМИ в депрессию слайд (рис 1А вставке). </li><li> С другой парой щипцов, держитесь экзоскелет на вентральной задней части брюшной полости и пробить. Возьмите яичников у заднего конца, то вытащить их из брюшной полости и поместить в свежую среду с другой стороны впадины слайда. (1А вставка). Избегайте потянув за исключением кишечник. Откажитесь от туши. </li><li> Повторите с другими женщинами мух, пока все яичники не расчленены. Откажитесь от мужчин. </li><li> С одной парой щипцов, удерживая яичника на заднем конце (около крупнейших яичных камер), а также с другой стороны использовать пару щипцов, чтобы зажать один из самых передних яиц камер (гермарии). (1А). </li><li> Медленно и постепенно, тянуть ovariole цепь из яичника оболочки. Продолжайте рассекать из овариол индивидуально, пока все нужные яичные камеры не гemoved. </li><li> Повторите шаги 1.7-1.8 для всех расчлененный яичников. </li><li> После завершения передачи овариол в 0,6 мл трубки с помощью пластиковой пипетки передачи. </li><li> Пусть овариол оседают на дно трубки, а затем приступить к фиксации и окрашивания шагов. </li></ol> 2. Иммунофлуоресцентного (IF) Окрашивание овариол <ol><li> Осторожно снимите рассечение СМИ от овариол с помощью пипетки. Будьте уверены, что не удалите все овариол яйцо или камеры. Оставьте примерно 50 мкл овариол и рассечение СМИ. </li><li> Добавить 50 мкл 16% параформальдегидом до 150 мкл 0,1 М КПО 4 буфера в трубке, и добавить решение яиц камер, чтобы исправить их. Инкубируют в то время качания в течение 10 мин. ВНИМАНИЕ: параформальдегиде является токсичным. </li><li> Удалить фиксатор и промыть в два раза с 0,5 мл NP40 промывочного буфера. </li><li> Вымойте два раза в течение 15 минут каждый при комнатной температуре. </li><li> Обратитесь к стандарту, если протокол 15 для последующих шагов. <ol><li> Если коротко, то после фиксации, добавитьПервичные антитела на соответствующих разведений и инкубировать O / N при 4 ° С. Промыть в NP40 несколько раз, а затем добавить вторичные антитела (1: 200) разведений. </li><li> Промыть несколько раз в NP40, затем добавить DAPI (1: 1000) в течение 10 мин, а затем повторить стирок. Один раз, если протокол будет завершена, добавить 200 мкл 50% глицерина в PBS, чтобы яйцо камер и оставьте при комнатной температуре в течение 2 часов. </li><li> Удалить решение заменить его 70% глицерина в PBS, и накрыть фольгой. Поместите образец на 4 ᵒC до готовности для монтажа. Между тем, продолжите с шага 3. </li></ol></li></ol> 3. Предварительная подготовка глицерина желе слайдов <ol><li> Измерьте по крайней мере 4 мл глицерина желе с помощью шпателя и заполнить трубу стекло культуре клеток в половине пути знак. Melt глицерина желе на водяной бане при 55 ° С в течение 30 мин. </li><li> Налейте небольшое падение глицерина, примерно 300 мкл, от маточного раствора на два микроскопа. Использование ткани, распространяется глицерин в тонком LAЙер на каждом из слайдов. Это обеспечивает основу и позволяет легко удаления глицерина желе на этапе 5.6. </li><li> Отрежьте кончик от фильтрованного пипетки 1000 мкл. Использование пипетки сокращают для передачи 1000-1500 мкл теплой желе глицерина медленно каждому предметное стекло. Позаботьтесь, чтобы предотвратить пузыри. </li><li> Пусть глицерин желе скользит сидеть в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы установить. </li><li> Поместите каждую глицерин желе слайд в 60 мм × 15 мм чашки Петри и накрыть полиэтиленовой пленкой. Место в 4 ° CO / N. Возможно, магазин глицерина желе слайды до 5 дней при 4 ° С. </li></ol> 4. Монтаж яйцо палаты <ol><li> Использование образцов, начиная с шага 2.5, пипетки несколько 3 мкл капель яичных камер в 70% глицерине через один глицерина желе слайда. Продолжить Пипетирование 3 мкл капли, пока все яйца камеры не на этом слайде. Убедитесь, что каждая капля содержит, по меньшей мере, десять яиц камер. Между тем, нагреть пробирку глицерина желе в C на водяной бане 55 °, </li><li> Поместите глицерин желе слайд с яйцом камер под микроскопом рассечение. Регулировка увеличения так, что только одна капля яиц камер в поле зрения (Фиг.1В). </li><li> Использование 30 иглы, ложки, подобрать нужный стадии яйца камеры. При необходимости, отдельные желаемые яичные камеры из в ovariole цепочку с помощью иглы, как ножом. </li><li> Чтобы избежать мусора, которые могут помешать изображений, передачи яйцо камеры во вторую глицерина желе слайд, с передней обращенной влево (фиг 1E -1). Повторяйте, пока не существует, по крайней мере семь яиц камеры выстроились в колонну (рис 1в). </li><li> Форма новые столбцы из семи, пока все нужные яичные камеры не передаются на второй глицерин желе слайда. </li><li> Оторвите небольшой кусочек ткани и твист. Используйте это, чтобы поглощать избыточную PBS глицерин из яиц камер, слегка касаясь каждой из них. Будьте осторожны, чтобы не удалить яичные камеры. </li><li> Отрежьтекончик пипетки фильтруют 200 мкл. Используйте это, чтобы передать 150 мкл глицерина желе, чтобы покрыть все столбцы яиц камер. ПРИМЕЧАНИЕ: количество глицерина желе, необходимых для покрытия столбцы основан на этапах камеры яйцо и число столбцов. Количество может быть отрегулирована. </li><li> Пусть установленные яичные камеры сидеть в течение 5 мин при комнатной температуре, пока верхний слой глицерина желе не будет полностью затвердевает (рис 1D). </li><li> Место слайд конных яиц камер в 60 мм × 15 мм чашки Петри и накрыть полиэтиленовой пленкой. Хранить при температуре 4 ° СО / N, чтобы позволить глицерин желе слои, чтобы укрепить вместе (место в темноте, если есть опасения по поводу фотообесцвечиванию). </li></ol> 5. Подготовка яичных палат для работы с изображениями <ol><li> Поместите слайд смонтированных яиц камер под микроскопом рассечение. Отрегулируйте увеличение, так что только одна колонка яиц камер находится в поле зрения. </li><li> Использование угол 45 ° миниатюрный скальпель, вырезать straigHT линии с правой стороны от первого столбца яиц камер (близких к задней стороне яйца камер). (Рисунок 1D-Е) </li><li> Далее, на голову выше первого яйца камеры в верхней и ниже последнего яйца камеры в колонке. В этот момент колонна яиц камер должны быть сокращены с трех сторон. </li><li> Использование microknife, срез вдоль левой стороны колонки, как можно ближе к передней стороне яйца камер (рис 1E -3). </li><li> Пипетировать 100 мкл холодной 1X PBT через колонку вырезом. </li><li> Используйте круглый краями шпателя, чтобы удалить лишнюю желе глицерина вокруг трех сторон разреза колонны яичных камер и отказаться, оставив остальное на слайде. </li><li> Вставьте шпатель в надреза на передней стороне яйца камер и отделить столбец из основного блока глицерин желе. </li><li> Подготовка образцов для любой перевернутые (5.8.1) или вертикально (5.8.2) микроскопии. <ol><li> Для инвертированный микроскоп: трансфер Tон колонна яиц камер для покровное с передней стороны яичных камер вниз. Повторите шаги 5,2-5,8 пока все столбцы глицерина желе не были удалены и установлены. Добавьте пару капель 50% PBS-глицерина на каждом блоке яичных камер, чтобы предотвратить их от высыхания. Изображение яичные камеры непосредственно на покровное. </li><li> Для вертикального микроскопа: Трансфер столбец из яиц камер для предметное стекло микроскопа с передней стороной вверх. Повторите шаги 5.2-5.9, пока все столбцы глицерина желе не были удалены и установлены на предметных стеклах. Добавьте пару капель 50% PBS-глицерина на каждом блоке яичных камер и крышки блоков с # 1 ½ покровное. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hudson, A. M., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+oogenesis.">Methods for studying oogenesis.</a> Methods. 68 (1), 207-217 (2014).</li><li>Bastock, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+oogenesis.">Drosophila oogenesis.</a> Curr Biol. 18 (23), R1082-R1087 (2008).</li><li>Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+follicle+cells:+morphogenesis+in+an+eggshell.">Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell.</a> Semin Cell Dev Biol. 19 (3), 271-282 (2008).</li><li>Bilder, D., Haigo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+morphogenetic+repertoire:+perspectives+from+the+Drosophila+egg.">Expanding the morphogenetic repertoire: perspectives from the Drosophila egg.</a> Dev Cell. 22 (1), 12-23 (2012).</li><li>Montell, D. J., Yoon, W. H., Starz-Gaiano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Group+choreography:+mechanisms+orchestrating+the+collective+movement+of+border+cells.">Group choreography: mechanisms orchestrating the collective movement of border cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (10), 631-645 (2012).</li><li>Spradling, A. C., Bate, M., Marinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+genetics+of+oogenesis.">Developmental genetics of oogenesis.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 1-70 (1993).</li><li>Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Border-cell+migration:+the+race+is+on.">Border-cell migration: the race is on.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 13-24 (2003).</li><li>Silver, D., Geisbrecht, E., Montell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+JAK/STAT+signaling+throughout+border+cell+migration+in+Drosophila.">Requirement for JAK/STAT signaling throughout border cell migration in Drosophila.</a> Development. 132 (15), 3483-3492 (2005).</li><li>Ghiglione, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+cytokine+receptor+Domeless+controls+border+cell+migration+and+epithelial+polarization+during+oogenesis.">The Drosophila cytokine receptor Domeless controls border cell migration and epithelial polarization during oogenesis.</a> Development. 129 (23), 5437-5447 (2002).</li><li>Denef, N., Sch&#252;pbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning:+JAK-STAT+signalling+in+the+Drosophila+follicular+epithelium.">Patterning: JAK-STAT signalling in the Drosophila follicular epithelium.</a> Curr Biol. 13 (10), R388-R390 (2003).</li><li>Beccari, S., Teixeira, L., R&#248;rth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK/STAT+pathway+is+required+for+border+cell+migration+during+Drosophila+oogenesis.">The JAK/STAT pathway is required for border cell migration during Drosophila oogenesis.</a> Mech Dev. 111 (1-2), 115-123 (2002).</li><li>Montell, D., Rorth, P., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=slow+border+cells,+a+locus+required+for+a+developmentally+regulated+cell+migration+during+oogenesis,+encodes+Drosophila+C/EBP.">slow border cells, a locus required for a developmentally regulated cell migration during oogenesis, encodes Drosophila C/EBP.</a> Cell. 71 (1), 51-62 (1992).</li><li>Xi, R., McGregor, J., Harrison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gradient+of+JAK+pathway+activity+patterns+the+anterior-posterior+axis+of+the+follicular+epithelium.">A gradient of JAK pathway activity patterns the anterior-posterior axis of the follicular epithelium.</a> Dev Cell. 4 (2), 167-177 (2003).</li><li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+wave+of+cellular+imaging.">A new wave of cellular imaging.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).</li><li>McDonald, J., Pinheiro, E., Kadlec, L., Schupbach, T., Montell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+EGFR+ligands+participate+in+guiding+migrating+border+cells.">Multiple EGFR ligands participate in guiding migrating border cells.</a> Dev Biol. 296 (1), 94-103 (2006).</li><li>Van de Bor, V., Zimniak, G., C&#233;r&#233;zo, D., Schaub, S., Noselli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+localisation+of+cytokine+mRNA+is+essential+for+JAK/STAT+activation+during+cell+invasiveness.">Asymmetric localisation of cytokine mRNA is essential for JAK/STAT activation during cell invasiveness.</a> Development. 138 (7), 1383-1393 (2011).</li><li>Hayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glypicans+regulate+JAK/STAT+signaling+and+distribution+of+the+Unpaired+morphogen.">Glypicans regulate JAK/STAT signaling and distribution of the Unpaired morphogen.</a> Development. 139 (22), 4162-4171 (2012).</li><li>Airoldi, S. J., McLean, P. F., Shimada, Y., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+protein+movement+in+syncytial+Drosophila+follicle+cells.">Intercellular protein movement in syncytial Drosophila follicle cells.</a> J Cell Sci. 124 (Pt 23), 4077-4086 (2011).</li><li>R&#248;rth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+gain-of-function+genetics+in+Drosophila).">Systematic gain-of-function genetics in Drosophila).</a> Development. 125 (6), 1049-1057 (1998).</li><li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies:+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast.">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).</li><li>Shimada, Y., Burn, K. M., Niwa, R., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+response+of+protein+localization+and+microtubule+organization+to+nutrient+stress+during+Drosophila+early+oogenesis.">Reversible response of protein localization and microtubule organization to nutrient stress during Drosophila early oogenesis.</a> Dev Biol. 355 (2), 250-262 (2011).</li><li>Qui&#241;ones-Coello, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+strategies+for+protein+trapping+in+Drosophila.">Exploring strategies for protein trapping in Drosophila.</a> Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).</li><li>Buszczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carnegie+protein+trap+library:+a+versatile+tool+for+Drosophila+developmental+studies.">The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies.</a> Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).</li><li>Belu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upright+imaging+of+Drosophila+embryos.">Upright imaging of Drosophila embryos.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li><li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-on+imaging:+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos.">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Dev Dyn. 237 (11), 3252-3259 (2008).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

Здесь мы опишем метод монтажа и изображение небольшой, развивающееся яйцо камеры с точки зрения конечного дальше. Общие методы для работы с изображениями яйца камер оптимизированы для боковым видом и, прежде всего, позволяют точно визуализировать Медио-боковая фолликулярных клеток п?...

Исследование дрозофилы оказывает большое понимание генетического регулирования в широком диапазоне явлений. В частности, было обширное исследование развития яиц, потому что оогенез обеспечивает послушный путь, чтобы исследовать различные процессов развития, в том числе ткани рисунка, изменения клеточной полярности, переключение клеточного цикла и поступательного регулирования 1,2,3,4. Одним из важных событий во морфогенетического оогенезе это спецификация, приобретение подвижности и миграции из набора клеток, называемых пограничные клетки (обзор в 5). Поскольку миграции клеток является ключевым признаком животного морфогенеза, и из-за генетического регулирование этого процесса хорошо сохраняется, механизмы, определенные в мух могут быть важными в других контекстах. Таким образом, мы исследуем молекулярную контроль миграции границы ячейки. Для наших исследований мы разработали новый метод, чтобы наблюдать передней полюсов развития яиц,где возникают пограничные клетки, чтобы изучить, как они развиваются в деталях. В яичнике, яичные камеры на различных стадиях развития существуют вдоль цепочек, называемых овариол, которые заключены в тонкий оболочки (рис 1А). Каждое яйцо камера будет перейти к форме одно яйцо. Во время оогенеза, несколько различных типов элементов должны развиваться в скоординированной манере. D. MELANOGASTER яйцо камера состоит из 16 зародышевой линии клеток, в том числе один ооцит, окруженный однослойной фолликулярного эпителия 6. Небольшое количество специализированных клеток, называемых полярных клетки, возникают на передней и задней опор эпителия. Пограничные клетки 6-8 происходят в передней эпителия яйцевой камеры, вызванного полярных клеток 5,7. В середине оогенеза (стадия 9), пограничные клетки отделяются от своих соседей и мигрируют между питающих клеток, чтобы достичь яйцеклетки на заднем яйцевой камеры 5,7. Это движение должно быть выполненов то время как пограничные клетки остаются в кластере окружающей два неподвижных белых клеток, что делает этот тип коллективной миграции клеток. Успешное миграция границ клеток кластера обеспечивает правильное развитие микропиле яичной скорлупы, которая необходима для оплодотворения. Передние полярные клетки указания судьбу границы клеток путем активации каскада трансдукции сигнала. Полярные клетки секретируют цитокин, непарных (UPD), который связывается с рецептором трансмембранной, Domeless (купол), на соседней ячейки стручка на стадии развития 8 ооцитов 8,9. Связывание UPD вызывает Janus тирозин-киназы (ЯК) фосфорилировать сигнал датчика и активатора транскрипции (STAT) 8,10,11. STAT затем переходит к ядру, чтобы активировать транскрипцию. Медленные Клетки границе (SLBO) является фактором транскрипции, который является прямым транскрипции цель STAT и также необходим для границы миграции клеток 12. Боковые виды яиц камер указывают тшляпа STAT деятельность регулируется в градиенте через передний эпителий 8,11,13. Фолликулярных клеток близкие к полярным клеток имеют самые высокие уровни активированного STAT, таким образом, они становятся пограничные клетки и вторгаются в соседнюю зародышевой линии ткани. Чтобы понять, как пограничные клетки указан внутри и отделить от эпителия, мы должны наблюдать, как ткань организована. Если мы рассматриваем яичные камеры от передне-на перспективу, можно было бы ожидать радиальную симметрию STAT деятельности в фолликулярных клеток, окружающих полярные клетки. Конечный на виду также более точно показать различия мембранных белков и межклеточных интерфейсов до и во время отрыва, чем сравнение клеток в различных фокальных плоскостях. Поскольку яйцо камеры продолговатые и прикреплены друг к другу с помощью стебля клеток, они оседают на предметные стекла в поперечном направлении, что делает его трудно наблюдать переднюю архитектуру. Таким образом, много информации о клетках на полюсах яиц камеры имеетбыли выведены из боковых взглядов. Хотя некоторая информация может быть получена путем алгоритмических 3-D реконструкций оптических секций, комбинационного рассеяния света, Фотообесцвечивания и бедных рамки резолюции в Z-оси сделать эту информацию более подробно и надежны в отсутствии дорогих методов, как супер-разрешением микроскопии 14 , Другие виды секции на основе изображений (например, электронная микроскопия или микротом секционирования) требуют больших манипуляций тканей, в том числе обезвоживания, увеличивая вероятность для артефактов. Таким образом, мы разработали новый метод к фотографиям D. MELANOGASTER яичные камеры в то время как в вертикальном положении. Этот метод уже доказали свою полезность в объяснении, как подвижные клетки суждено (см репрезентативные результаты и штатное др рассматривается), и, вероятно, будет более широко ценным при исследовании других аспектов оогенеза.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1027">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:348px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:279px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:283px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="96">
			<td height="96" style="height:96px;width:348px;">0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer)</td>
			<td style="width:279px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:283px;">Add 3.1 g of NaH2PO4&#8226;H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 mo at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:348px;">16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade</td>
			<td style="width:279px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td>methanol-free to preserve GFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">30G x 1/2 inch needle&#160;</td>
			<td style="width:279px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BD305106</td>
			<td>Regular bevel</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:348px;">Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:279px;">Genesee Scientific</td>
			<td>62-103</td>
			<td>To fatten female flies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:279px;">PAA-cell culture company</td>
			<td style="width:119px;">A15-701</td>
			<td>Used in NP40 Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:348px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:279px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11295-10</td>
			<td style="width:283px;">Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:348px;">DAPI (4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td style="width:279px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td style="width:283px;">5mg/ml stock solution&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:348px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:279px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16140-071</td>
			<td style="width:283px;">Added to supplement dissection medium (10%)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:348px;">Glass culture tube</td>
			<td style="width:279px;">VWR</td>
			<td>47729-576</td>
			<td>14mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Glass Depression Slides</td>
			<td style="width:279px;">VWR</td>
			<td>470019-020</td>
			<td>1.2 mm Thick, Double Cavity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Glycerin Jelly&#160;</td>
			<td style="width:279px;">Electron Microsocpy Sciences</td>
			<td>17998-10</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Glycerol</td>
			<td style="width:279px;">IBI Scientific</td>
			<td style="width:119px;">IB15760</td>
			<td>70% in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:348px;">IGEPAL CA-630</td>
			<td style="width:279px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I3021-500ML</td>
			<td style="width:283px;">(interchangable for Nonidet P-40)&#160; Used in NP40 Wash Buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Leica Fluorescent Stereoscope&#160;</td>
			<td style="width:279px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Leica SP5 Confocal Microscope</td>
			<td style="width:279px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>40x/0.55NA dry objective&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Micro spatula&#160;</td>
			<td style="width:279px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82027-518</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Microknife&#160;</td>
			<td style="width:279px;">Roboz Surgical Instrument Company</td>
			<td style="width:119px;">37-7546</td>
			<td>45&#7506; angle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Microscope Slide</td>
			<td style="width:279px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">16004-368</td>
			<td>75x25x1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:348px;">NP40 Wash Buffer</td>
			<td style="width:279px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:283px;">50mM TRIS-HCL, 150mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Penicillin-Streptomycin-Glutamine</td>
			<td style="width:279px;">Life Technologies</td>
			<td>10378-016</td>
			<td>Added to supplement dissection medium (0.6X)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Petridish- Polysterine, sterile</td>
			<td style="width:279px;">VWR</td>
			<td>82050-548</td>
			<td>60Wx15H mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Phosphate Buffer Saline</td>
			<td style="width:279px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P3813-10PAK</td>
			<td>10 packs of Powder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:279px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P3786-500G</td>
			<td>Used in 0.1M KPO4 Buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:279px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9791-500G</td>
			<td>Used in 0.1M KPO4 Buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Schneider&#8217;s Insect Medium</td>
			<td style="width:279px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"> 
			11720018</td>
			<td>With L-glutamine and sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:348px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:279px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002-25G</td>
			<td>Used in fluorescent antibody staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:279px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S3014-500G</td>
			<td>Used in NP40 Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">TRIS-HCL</td>
			<td style="width:279px;">IBI Scientific</td>
			<td style="width:119px;">IB70144</td>
			<td>1M TRIS-HCL, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Volocity 3D Image Analysis Software</td>
			<td style="width:279px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For processing confocal Z-stacks</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

upright imaging of drosophila egg chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Метод прямой визуализации позволил нам увидеть непосредственно в организацию клеток в передней фолликулярного эпителия на стадии 8. общим маркером для судьбы фолликул клеток, об отсутствии Глаза (ЕЯ) белок, а также маркер ядерной ДНК DAPI, показали даже выражение по этой области клеток, и...

Watch this Scientific Journal Video about Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers at JoVE.com

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Вертикальный Визуализация<em&gt; Drosophila</em&gt; Яйцо палат

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

upright-imaging-of-drosophila-egg-chambers

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

7.5K Views.  University of Maryland Baltimore County. The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Video: Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-визуализация<em&gt; Drosophila</em&gt; Куколки глаз

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

This article describes an adaptable ex vivo protocol for visualizing Ca2+ during egg activation in Drosophila.

Визуализации кальция в<em&gt; Drosophila</em&gt; При активации Egg

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Долгосрочный Живая съемка<em&gt; Drosophila</em&gt; Диски глаз

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

В естественных условиях Imaging мышц сухожилие морфогенеза в куколки дрозофилы

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

Анализ динамики actomyosin на местных сотовых и тканевых весов использованием покадровой фильмы культурных Дрозофила яйцо камер

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Live Imaging и анализ мышечных сокращений в дрозофилы эмбриона

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Размораживание, культивирования и Cryopreserving дрозофила клеточных линий

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Human Egg Maturity Assessment and Its Clinical Application

The optimal timing of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is of a serious concern for fertility programs because untimely sperm entry diminishes the egg&#39;s developmental competence. Presence of the first polar body (PB) together with the meiotic spindle indicates completion of the oocyte maturation and the egg&#39;s readiness for fertilization. In clinical practice, it is customary to assume that all oocytes displaying a PB are mature metaphase (MII) oocytes. However, PB extrusion precedes the formation of the bipolar MII spindle. This asynchrony makes the mere presence of PB an unreliable marker of oocyte maturity. Noninvasive spindle imaging using polarized light microscopy (PLM) allows quick and easy inspection of whether the PB-displaying oocyte actually reassembled a meiotic spindle prior to ICSI. Here, we present a standard protocol to perform human egg maturity assessment in the clinical laboratory. We also show how to optimize the time of ICSI with respect to the oocyte&#39;s developmental stage in order to prevent premature sperm injection of late-maturing oocytes. Using this approach, even immature oocytes extruding PB in vitro can be clinically utilized. Affirmation that MII spindle is present prior to sperm injection and individual adjustment of the time of ICSI is particularly important in poor prognosis in-vitro fertilization (IVF) cycles with a low number of oocytes available for fertilization.

We provide an outline of the clinical protocol for non-invasive assessment of human egg maturity using polarized light microscopy.

Оценка зрелости яйцеклеток человека и его клиническое применение

The optimal timing of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is of a serious concern for fertility programs because untimely sperm entry diminishes the ...

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in multicellular organisms. The TGF-&#946; superfamily includes TGF-&#946;, bone morphogenetic protein (BMPs), Activins, Growth and Differentiation Factors, and Nodals. It has long been known that the amount of ligand exposed to cells is important for its effects. It was thought that long-range concentration gradients set up embryonic pattern. However, recently it has become clear that the timing of exposure to these ligands is also important for their downstream transcriptional consequences. A TGF-&#946; superfamily ligand cannot have a developmental consequence until it is released from the cell in which it was produced. Until recently, it was difficult to determine when these ligands were released from cells. Here we show how to measure the release of a Drosophila BMP called Decapentaplegic (Dpp) from the cells of the wing primordium or wing disc. This method could be modified for other systems or signaling ligands.

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

The timing of exposure to ligands may impact their developmental consequences. Here we show how to image release of a Drosophila bone morphogenetic protein (BMP) called Dpp from cells of the wing disc.

Изображение Dpp Релиз из drosophila крыла диска

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.