Этот метод позволяет наблюдать длительные биологические процессы в расццененных камерах яйцеклеток дрозофилы, такие как миграция ядер ооцитов, с помощью живой визуализационной микроскопии. Этот протокол описывает, как поддерживать рассеченные яйцеклетки живыми в течение 12 часов для выполнения микроскопии в реальном времени. Для начала пипетка 200 микролитров Schneider Medium и дополнение 30 микролитров по 10 миллиграммов на миллилитр инсулина, затем добавляют четыре микролитра инактивированной теплой икроножной сыворотки плода.
Используйте наконечник пипетки, чтобы нанести небольшое количество силиконовой смазки по всему отверстию на нижней стороне проколотого слайда. Расположите крышку и используйте широкий конец наконечника пипетки, чтобы оказать давление на крышку, чтобы сгладить силиконовую смазку для создания силиконового кольца внутри слайда. Перенесите обезболенную самку мух в рассекающий колодец, содержащий 150 микролитров среды визуализации.
Для рассечения самки используйте щипцы, чтобы схватить грудную клетку и зажать дорсальную кутикулу живота второй парой щипцов. Осторожно удалите матку, яйцевод и мышечную оболочку. Изолируйте и отсоедините пару яичников, видимых на отверстии кутикулы.
Поместите каплю от 10 до 15 микролитров среды визуализации на яичники и перенесите один яичник в камеру визуализации. Для отделения яриолов используйте иглу, чтобы удерживать задний конец яичники. Используйте другую иглу, чтобы осторожно вытащить гермарий для поддразнивания яриолов.
Удерживайте оболочку одной иглой и протяните овариол через более крупные камеры другой иглой, чтобы удалить оставшуюся мышечную оболочку на яйцеклетках. Позвольте овариолу без обшивки опуститься и соприкоснуться с крышкой. Удалите поздние стадии и остальную часть яичников из микрокамеры с помощью щипцов.
Используйте иглы, чтобы тщательно дистанцировать овариоли, чтобы облегчить приобретение. Вырежьте небольшой квадрат проницаемой мембраны 10 на 10 миллиметров. Осторожно нанесите мембрану на верхнюю часть среды визуализации, чтобы изгнать любые пузырьки воздуха.
Затем герметично запечатайте камеру тонким слоем галокарбонового масла вокруг скважины по контуру мембраны. Поместите настройку визуализации на держатель слайда перевернутого микроскопа и используйте объектив 40X. Миграция ядра яйцеклетки дикого типа была зафиксирована с помощью живой визуализационной микроскопии.
Ядро достигает либо передней плазматической мембраны, либо боковой плазматической мембраны, прежде чем скользить по траекториям, чтобы достичь своего конечного положения на пересечении двух плазматических мембран. Деформации мембран, дезорганизованные фолликулярные клетки, задержка в прорастая клетках и сморщенные ядра являются первыми признаками умирания яйцеклеток. Дегенерированная яйцеклетка до восьми часов визуализации обычно не обнаруживается.
Однако редкие случаи ранней дегенерации обусловлены проблемами во время рассечения или монтажных этапов. Повреждение яичных камер ставит под угрозу их выживание. Поэтому тонкая рука, точное рассечение и подготовка микрокамеры имеют первостепенное значение.
Эта процедура позволила нам визуализировать, что ядро ооцита может принимать три разные траектории во время своей миграции, и разные органеллы регулируют эти траектории внутри ооцита.
