Добро пожаловать все. Меня зовут Вин Сурачетпонг. Я доцент кафедры ветеринарной микробиологии и иммунологии ветеринарной медицины Университета Касетстарт, Таиланд.
Я и моя команда специализируемся на новых вирусных заболеваний в тилапии. В настоящее время мы работаем над вирусом озера Тилапия, который вызывает высокую смертность в тилапии. Поскольку тилапия является вторым по величине видом рыб, который является культурой во всем мире, она обеспечивает источником белка для миллиона человек и играет важную роль в продовольственной безопасности.
Так недавняя вспышка вируса озера Тилапия вызвать социально-экономические последствия, которые привели многих ученых, чтобы попытаться найти решение этой проблемы. Пока нам нужен очень чувствительный, быстрый и точный метод для обнаружения вируса. В этом видео, мы покажем вам шаг за шагом, чтобы обнаружить вирус озера тилапии в рыбьей ткани, начиная с сбора образцов, выборка населения, и в режиме реального времени ПЦР анализа.
Во-первых, solubilize передозировки тканевого масла в воде, чтобы усыпить рыбу. Поместите мертвую рыбу на поднос, стерилизовать оборудование с использованием 95% этанола, а затем сожгли с алкогольной горелки. Медленно разрежьте рыбу из нижней части живота вверх, чтобы собрать печень.
Соберите часть печени в 1,5 миллилитровую центрифугу. Первая часть извлечения РНК должна быть выполнена в Ламинарной капюшоне потока и носить защитное оборудование. Добавьте в трубку один миллилитр реагента извлечения РНК.
Pulverize печени с помощью ткани пестик в однородной. Добавьте в трубку 200 микролитров хлороформа. Затем аккуратно перемешайте трубку несколько раз.
Отложите на три минуты при комнатной температуре. Центрифуга при четырехградусах по Цельсию при 12 000 RCF в течение 15 минут. Аккуратно соберите трубки из центрифуги.
Аккуратно перенесите 500 микролитров бесцветной верхней фазы в новую трубку. Добавьте один том изопропанола в трубку. Тепло при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение двух часов или до ночи, чтобы вызвать РНК.
После инкубации центрифуга раствора в том же состоянии центрифуги. Соберите трубки из центрифуги, а затем отбросьте супернатант. Гранулы РНК можно увидеть, как указал на стрелку.
Добавьте один миллилитр 75%этанола в трубку, чтобы вымыть гранулы РНК, и инвертировать несколько раз. Центрифуга при четырех градусах по Цельсию, при 10 000 RCF в течение 15 минут. Соберите трубки из центрифуги, а затем отбросьте супернатант.
Нарисуйте оставшийся этанол с помощью автоматической трубы, и воздух сухой при комнатной температуре в течение пяти до 10 минут. Добавить от 30 до 60 микролитров RNase свободной воды, предварительно нагревается до 55 до 60 градусов по Цельсию, чтобы solubilize РНК гранулы. Используйте один-два микролитера РНК-раствора для измерения концентрации с помощью микрообнамеренного спектрофотометра.
Результаты будут показаны на экране. Разбавить концентрацию до 200 нанограмм на микролитер с помощью свободной воды RNase. Выполните синтез кДНК с использованием химических веществ и условий, перечисленных следующим образом.
Используйте термоциклер для преобразования РНК в cDNA с предлагаемыми условиями. Ниже приведены химические вещества и условия, используемые для определения нагрузки TiLV с использованием ПЦР в режиме реального времени. Разпределите шесть миллилитров мастер-микса qPCR в каждый флакон белой трубки полосы qPCR.
Впоследствии в колодец загружаются четыре миллилитров образца кДНК. На этом этапе новый наконечник трубы должен быть изменен в каждой из них, чтобы избежать загрязнения от образца к образцу. Печать полосы qPCR плотно с прозрачной крышкой полосы qPCR.
Аккуратно смешайте раствор, щелкивая на кончике полосы. Затем спина вниз с помощью микро центрифуги, чтобы собрать всю жидкость на дне сосудов. Используйте два шага условие, как показано на видео, выберите хорошо в 96 хорошо пластины, которые вы собираетесь использовать.
Выберите кибер-зеленый, как флора для красителя. Выберите неизвестный тип образца и вставьте имя в поле имени образца. Откройте крышку машины PCR в режиме реального времени и поместите полосу qPCR в назначенный колодец.
Затем закройте крышку. Запустите машину с выбранным условием. Машина запустится и запустится после того, как крышка достигла желаемой температуры.
После окончания условий qPCR отображается кривая усиления. Здесь стрелка скорости указывает, где пороговый уровень отрезается между экспоненциальной фазой и линейной фазой, что приводит к значению КТ. Значение КТ затем экстраполируется на номер копирования вирусного журнала для расчета количества вирусов, останков с использованием стандартной кривой.
Пик таяния также отображается для определения того, является ли вирус, обнаруженный qPCR, действительно, TiLV, в котором пики расплава обычно варьируются от 79,5 до 80,5 градусов по Цельсию. Поэтому мы надеемся, что этот метод будет важным инструментом для фермеров и организаций по всему миру, которые могут потребовать осуществления контроля и ограничения распространения инфекции TiLV.
