皆を歓迎します。私の名前はウィン・スラチェッポンです。タイのカセットスタート大学で獣医微生物学・免疫学部の助教授をしています。
私と私のチームは、ティラピアの新興ウイルス性疾患に特化しています。私たちは現在、ティラピアで高い死亡率を引き起こすティラピア湖ウイルスに取り組んでいます。ティラピアは世界で2番目に重要な魚種であるため、100万人にタンパク質源を提供し、食料安全保障に重要な役割を果たしています。
だから、ティラピア湖ウイルスの最近の流行は、多くの科学者がこの問題の解決策を見つけようとする社会経済的影響を引き起こします。これまでのところ、我々は非常に非常に敏感で、迅速かつ正確なウイルスを検出する方法が必要です。このビデオでは、サンプル採取、サンプル集団、リアルタイムPCR分析から始まる魚組織のティラピア湖ウイルスを検出するためのステップバイステップを紹介します。
まず、水に布油の過剰摂取を可溶化し、魚を安楽死させる。トレイに死んだ魚を置き、95%エタノールを使用して機器を殺菌し、アルコールバーナーで焼きます。ゆっくりと下腹部から魚を切り開き、肝臓を採取する。
肝臓の一部を1.5ミリリットルの遠心分離チューブに集める。RNA抽出の最初の部分は、ラミナーフローフードで行われ、保護具を着用する必要があります。チューブに1ミリリットルのRNA抽出試薬を加えます。
均質に組織の害虫を使用して肝臓を粉砕.200マイクロリットルのクロロホルムをチューブに加えます。その後、チューブを数回反転して軽く混ぜます。
室温で3分間脇に置きます。12,000 RCFで摂氏4度で15分間遠心分離します。慎重に遠心分離機からチューブを収集します。
無色の上水相の500マイクロリットルを新しいチューブに静かに移します。チューブにイソプロパノールの1つのボリュームを追加します。RNAを沈殿させるためにマイナス20度で2時間または一晩まで加熱します。
インキュベーション後、同じ遠心分離条件で溶液を遠心分離する。遠心分離機からチューブを収集し、上清を捨てます。RNAペレットは、矢印によって指すように見ることができます。
75%エタノールを1ミリリットル加えて、RNAペレットを洗浄し、数回反転させます。摂氏4度の遠心分離機、10,000 RCFで15分間。遠心分離機からチューブを収集し、上清を捨てます。
オートピペットを使用して残ったエタノールを引き出し、室温で5〜10分間空気乾燥します。30~60マイクロリットルのRNaseフリーウォーターを加え、55~60°Cにあらかじめ温め、RNAペレットを可溶化します。1~2マイクロリットルのRNA溶液を使用して、マイクロ体積分光光度計を用いて濃度を測定します。
結果が画面に表示されます。RNaseフリーウォーターを使用して、1マイクロリットル当たり200ナノグラムに濃度を希釈します。以下に記載されている化学物質および条件を用いてcDNA合成を行う。
サーモサイクラーを使用して、提案された条件でRNAをcDNAに変換します。以下は、リアルタイム PCR を使用して TiLV 負荷を決定するために使用される化学物質と条件です。qPCRマスターミックスの6ミリリットルを白いqPCRストリップチューブの各バイアルに分配します。
その後、4ミリリットルのcDNAサンプルがウェルにロードされます。この段階では、サンプルからサンプルへの汚染を避けるために、新しいパイプ先端をすべてのウェルで交換する必要があります。透明なqPCRストリップキャップでqPCRストリップをしっかりと密封します。
ストリップの先端でフリックして溶液を軽く混ぜます。その後、マイクロ遠心分離機を使用してスピンダウンし、容器の底にあるすべての液体を収集します。ビデオに示すように2つのステップ条件を使用して、あなたが使用しようとしている96ウェルプレートでウェルを選択します。
色素の植物相としてサイバーグリーンを選択します。サンプルタイプとして「不明」を選択し、サンプル名ボックスに名前を挿入します。リアルタイム PCR マシンの蓋を開き、qPCR ストリップを割り当てられたウェルに配置します。
その後、蓋を閉じます。選択した条件でマシンを実行します。蓋が希望の温度に達した後、機械は起動して実行されます。
qPCR条件の終了後、増幅曲線が示される。ここで、レート矢印は、CT値をもたらす指数位相と線形位相の間でしきい値レベルが切り取られる場所を示しています。CT 値はウイルス ログ コピー番号に外挿され、標準曲線を使用して残るウイルスの数を計算します。
融解ピークはまた、qPCRによって検出されたウイルスが、実際には、溶融ピークが一般的に摂氏79.5〜80.5度の範囲のTiLVであるかどうかを識別するために表示される。ですから、この方法が、制御を実施し、TiLV感染の拡散を制限する必要がある世界中の農家や組織にとって重要なツールになることを願っています。
