Willkommen alle. Mein Name ist Win Surachetpong. Ich bin Assistenzprofessor für Veterinärmikrobiologie und Immunologie Fakultät für Veterinärmedizin an der Kasetstart University, Thailand.
Ich und mein Team sind spezialisiert auf neu auftretende Viruserkrankung in Tilapia. Wir arbeiten jetzt an dem Tilapia-Seevirus, das eine hohe Sterblichkeit in Tilapia verursacht. Da Tilapia die zweitwichtigste Fischart ist, die Kultur weltweit ist, stellt sie Proteinquelle für eine Million Menschen und spielt eine wichtige Rolle für die Ernährungssicherheit.
Der jüngste Ausbruch des Tilapia-Seevirus hat sozioökonomische Auswirkungen, die viele Wissenschaftler dazu veranlassten, eine Lösung für dieses Problem zu finden. Bisher brauchen wir eine sehr hochsensible, schnelle und genaue Methode, um das Virus zu erkennen. In diesem Video zeigen wir Ihnen Schritt für Schritt, um Tilapia-Seevirus im Fischgewebe zu erkennen, beginnend mit der Probenentnahme, der Probenpopulation und der Echtzeit-PCR-Analyse.
Erstens, löslichdie Überdosierung von Stofföl in Wasser, um die Fische einzuschläfern. Legen Sie den toten Fisch auf ein Tablett, sterilisieren Sie das Gerät mit 95% Ethanol und verbrennen Sie dann mit einem Alkoholbrenner. Langsam den Fisch aus dem Unterbauch nach oben schneiden, um die Leber zu sammeln.
Sammeln Sie einen Teil der Leber in ein 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr. Der erste Teil der RNA-Extraktion sollte in einer Laminar Flow Hood durchgeführt werden und Schutzausrüstung tragen. Fügen Sie einen Milliliter RNA-Extraktionsreagenz in die Röhre.
Pulverisieren Sie die Leber mit einem Gewebestöße in homogen. 200 Mikroliter Chloroform in die Röhre geben. Dann vorsichtig mischen, indem Sie das Rohr mehrmals invertieren.
Drei Minuten bei Raumtemperatur beiseite stellen. Zentrifuge bei vier Grad Celsius bei 12 000 RCF für 15 Minuten. Sammeln Sie die Rohre vorsichtig aus der Zentrifuge.
500 Mikroliter der farblosen oberen wässrigen Phase vorsichtig in ein neues Rohr übertragen. Fügen Sie ein Volumen Isopropanol in die Röhre. Erhitzen Sie bei minus 20 Grad Celsius für zwei Stunden oder bis über Nacht, um die RNA auszufällen.
Zentrifugieren Sie die Lösung nach der Inkubation bei gleichem Zentrifugenzustand. Sammeln Sie die Rohre aus der Zentrifuge, dann entsorgen Sie den Überstand. Das RNA-Pellet kann durch den Pfeil als spitz gesehen werden.
Fügen Sie einen Milliliter 75% Ethanol in die Röhre, um das RNA-Pellet zu waschen, und mehrmals invertieren. Zentrifuge bei vier Grad Celsius, bei 10 000 RCF für 15 Minuten. Sammeln Sie die Rohre aus der Zentrifuge, dann entsorgen Sie den Überstand.
Ziehen Sie das übrig gebliebene Ethanol mit der Autopipette heraus und trocknen Sie bei Raumtemperatur fünf bis zehn Minuten. Fügen Sie 30 bis 60 Mikroliter RNase freies Wasser hinzu, das auf 55 bis 60 Grad Celsius vorgewärmt wird, um das RNA-Pellet zu sonlubilisieren. Verwenden Sie ein bis zwei Mikroliter RNA-Lösung, um die Konzentration mit einem Mikrovolumenspektrophotometer zu messen.
Die Ergebnisse werden auf dem Bildschirm angezeigt. Verdünnen Sie die Konzentration auf 200 Nanogramm pro Mikroliter mit RNase-freiem Wasser. Führen Sie die cDNA-Synthese unter Verwendung der chemikalien- und wie folgt aufgeführten Chemikalien und Bedingungen durch.
Verwenden Sie einen Thermocycler, um RNA in cDNA mit vorgeschlagenen Bedingungen umzuwandeln. Im Folgenden sind die Chemikalien und Bedingungen zur Bestimmung der TiLV-Last mit Echtzeit-PCR verwendet. Geben Sie sechs Milliliter des qPCR-Master-Mix in jede Durchstechflasche mit weißem qPCR-Streifenrohr.
Anschließend werden vier Milliliter cDNA-Probe in den Brunnen geladen. In diesem Stadium muss in jedem einzelnen Brunnen eine neue Rohrspitze ausgetauscht werden, um eine Kontamination von Probe zu Probe zu vermeiden. Versiegeln Sie den qPCR-Streifen fest mit einer transparenten qPCR-Streifenkappe.
Mischen Sie die Lösung vorsichtig, indem Sie an einer Spitze des Streifens flicken. Dann drehen Sie sich mit Mikrozentrifuge, um die gesamte Flüssigkeit am Boden der Gefäße zu sammeln. Verwenden Sie die zweistufige Bedingung, wie im Video gezeigt, wählen Sie den Brunnen in 96 Well-Platte, die Sie verwenden werden.
Wählen Sie Cyber-Grün als Flora für Farbstoff. Wählen Sie unbekannt als Beispieltyp aus, und fügen Sie einen Namen in ein Beispielnamensfeld ein. Öffnen Sie den Deckel einer Echtzeit-PCR-Maschine und legen Sie den qPCR-Streifen in den zugewiesenen Brunnen.
Schließen Sie dann den Deckel. Führen Sie das Gerät mit der ausgewählten Bedingung aus. Die Maschine startet und läuft, nachdem der Deckel die gewünschte Temperatur erreicht hat.
Nach dem Ende der qPCR-Bedingungen wird die Verstärkungskurve angezeigt. Hier zeigt der Kurspfeil, wo der Schwellenwert zwischen der Exponentialphase und der linearen Phase abschneidet, was zu einem CT-Wert führt. Der CT-Wert wird dann in die Kopiernummer des Virusprotokolls extrapoliert, um eine Anzahl von Virusresten mithilfe der Standardkurve zu berechnen.
Der Schmelzgipfel wird auch angezeigt, um festzustellen, ob das von qPCR entdeckte Virus tatsächlich TiLV ist, in dem die Schmelzspitzen im Allgemeinen zwischen 79,5 und 80,5 Grad Celsius liegen. Wir hoffen daher, dass diese Methode wichtige Instrumente für Landwirte und Organisationen auf der ganzen Welt sein wird, die möglicherweise eine Kontrolle durchführen und die Ausbreitung der TiLV-Infektion begrenzen müssen.
