Этот метод может быть использован для обнаружения сальмонеллы из образцов пищи и выявления патогена до уровня штамма с помощью генетической дактилоскопии. Основным преимуществом этого метода является то, что он сочетает в себе обнаружение сальмонеллы и субтипирование в один рабочий процесс и существенно сокращает время оборота от сальмонеллы загрязненных образцов пищи по отпечаткам пальцев патогена. Для начала, асептически поместите 25-граммовый образец пищи в стерильный лабораторный блендер мешок со встроенным фильтром или дополнительно подготовить мазок окружающей среды, асептически увлажняя губку с обогащением бульона, перетаскивая его через заранее определенную поверхность и поместив его в блендер мешок.
Используя лабораторный блендер, тщательно смешайте каждый образец с 225 миллилитров бульона обогащения Р.В. Затем инкубировать смесь при 42 градусах по Цельсию в течение четырех-двух часов. После этого соберите 50-миллилитровый подсемейный бульон для обогащения с фильтрованной стороны мешка.
Затем центрифугировать подраздел при 100 раз г в течение 10 минут. Тщательно перенесите супернатант в новую 50-миллилитровую центрифугу и центрифугу при 3000-6000 раз г в течение 10 минут. Откажитесь от супернатанта и вымойте гранулы в пяти миллилитров BPW.
Повторное производство гранул в пяти миллилитров BPW. Во-первых, оттаивать буфер выборки и буфер реакции из комплекта MDA на льду. Поместите один миллилитр рсузированных клеток в BPW и 20 микролитров анти-Salmonella шарики в микроцентрифуг трубки.
Поместите трубку микроцентрифуга на вращающийся миксер на 30 минут при комнатной температуре. После этого поместите трубку на магнитную подстоять в течение трех минут. Инвертировать магнитную стойку несколько раз, чтобы сконцентрировать бисер в гранулы.
Ведение трубки на магнитной стойке, аспирировать и отказаться от супернатанта. Затем добавьте в трубку один миллилитр буфера для мытья. Удалите держатель трубки из стойки и инвертировать держатель трубки несколько раз, чтобы удалить любые не специально связывающие бактерии из комплекса.
После третьей стирки, аспирировать супернатант из трубки и отказаться от него. Затем снимите трубку с магнитной стойки и центрифуга ее на одну секунду. Затем поместите трубку на магнитную стойку в течение трех минут, прежде чем удалить любой остаточный буфер мытья.
Resuspend бисера сальмонеллы комплексов в девяти микролитров образца буфера и инкубировать трубку при 95 градусов по Цельсию в течение трех минут. После охлаждения комплексов на льду добавьте девять микролитров буфера реакции и один микролитер ферментной смеси. Инкубировать трубку в тепловой циклер в соответствии с текстовым протоколом и охладить трубку на льду.
Далее используйте флюороспектрометр для измерения концентрации ДНК и чистоты образца. Храните конечные продукты при отрицательном 20 градусов по Цельсию для будущих экспериментов. Подготовка 18 микролитров смеси ПЦР на образец в соответствии с текстовым протоколом.
Затем смешайте продукт MDA, аккуратно трубя вверх и вниз. Добавьте два микролитров подвески продукта MDA в смесь ПЦР. Используя оптимизированный протокол PCR в режиме реального времени, запустите ПЦР в режиме реального времени в соответствии с текстовым протоколом.
Добавьте буферные решения и реагенты в продукт MDA, как указано в текстовом протоколе, и перенесите полученные 40 микролитров секвенирования подготовленного продукта MDA на новую пластину и добавьте 20 микролитров шариков очистки ПЦР к каждой хорошо. Затем инкубировать тарелку при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем вымойте шарики 80%этанолом и высушите их в течение 12 минут.
Переподходить сушеные бусы в 53 микролитров буфера повторного незаменимия и инкубировать бисер в течение двух минут при комнатной температуре. Наконец, разбавить и бассейн библиотек в соответствии с инструкциями производителя. В этом протоколе, целевая оценка количества ДНК сальмонеллы была выполнена в режиме реального времени ПЦР.
Репрезентативные результаты двух марок зараженной сальмонеллой куриной грудки варьировались от 701,54 до 945,86 нанограмма на микролитер, что свидетельствует о том, что образец ДНК был эффективно усилен. При попытке этой процедуры, важно помнить, мыть и обрабатывать IMS шарики тщательно, держать MDA реагентов и продуктов, свободных от загрязняющих веществ и поддерживать чистый капюшон. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области безопасности пищевых продуктов и общественного здравоохранения для изучения быстрого и высокого разрешения отслеживания загрязняющих веществ сальмонеллы в образцах пищевых продуктов, окружающей среды продуктов и цепочек поставок.
Не забывайте, что работа с пищевыми патогенами может быть чрезвычайно опасным и такие меры предосторожности, как ношение средств индивидуальной защиты и после хорошей лабораторной практики всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
